HLA-DRB1作為兒童自身免疫性肝炎的危險因素及其與甲型肝炎感染的關係

背景

人類白細胞抗原(HLAs)是在幾乎所有有核細胞的細胞膜上發現的蛋白質。具有某些HLA抗原的人更容易患某些自身免疫性疾病。本研究的目的是確定HLA-DRB1在自身免疫性肝炎(AIH)患兒中作為發生危險因素的頻率，及其與既往甲肝感染和治療結果的關係。

對象和方法

用序列特異性寡核苷酸探針技術對25例AIH兒童HLA-DRB1進行分型，並與548例正常人群HLA-DRB1進行比較。

結果

在AIH患兒中最常見的等位基因是HLA-DRB1*13 (36%)， HLA-DRB1*04(18%)和HLA-DRB1*03(14%)。HLA-DRB1*13在AIH患者中明顯高於對照組。在I型AIH患者中，HLA-DRB1*13是最常見的等位基因(32.4%)，其次是HLA-DRB1*04(20.6%)和HLA-DRB1*03(14.7%)，而在II型AIH患者中，HLA-DRB1*13(40%)、HLA-DRB1*07(20%)和HLA-DRB1*15(20%)是最常見的等位基因。HLA-DRB1*12在甲肝IgM陽性的AIH患者中明顯高於甲肝IgM陰性的AIH患者。HLA-DRB1亞型在部分應答者和完全應答者之間無統計學差異。

結論

本研究認為HLA-DRB1*13可能是本人群自身免疫性肝炎發生的易感等位基因。HLA-DRB1*07和HLA-DRB1*15可能是自身免疫性肝炎2型發生的易感等位基因。HLA-DRB1*12與甲型肝炎患者AIH的相關性有待進一步研究。

自身免疫性肝炎(AIH)是一種原因不明的慢性肝髒疾病，在未經治療的情況下會導致肝硬化和肝衰竭。該病通常發生於女性，其特征是存在循環自身抗體和肝活檢顯示嚴重的界麵肝炎[1］．

根據血清學標記已經提出了兩種AIH類型，1型AIH是世界上最常見的類型，而2型AIH主要發生在兒童和歐洲[2］．

盡管AIH的病因尚不清楚，但其表達與遺傳和環境因素有關[3.］．強有力的證據表明，自身反應的免疫控製缺陷在AIH的發病機製中發揮作用[4］．

HLA抗原是人體免疫係統識別和區分自身和非自身的主要決定因素。有許多不同的主要組織相容性(HLA)蛋白，每個人隻擁有從父母那裏遺傳來的一個相對獨特的小組[5］．

自身免疫性疾病是易感基因和觸發環境因子相互作用的結果，導致自身耐受性的喪失和自體細胞和/或組織的免疫介導破壞。HLA複合體中的基因是最強的易感遺傳因素[6］．在自身免疫性肝炎患者中，HLA DRB陽性患者比其他患者更容易患病[7］．盡管從理論上講，藥物和毒素可能會影響免疫穩態並引發AIH，但在這方麵研究的主要是病毒[8］．

本研究的目的是確定HLA-DRB1在自身免疫性肝炎患者中作為發生危險因素的頻率、其與先前HAV感染的關係以及治療結果。

本研究從兒童醫院肝病科門診定期就診的患者中招募了25名AIH患兒;Ain Shams醫學院和Yassin Abd El-Ghaffar教授肝髒疾病和研究慈善中心都是三級轉診中心。手術是根據艾因·沙姆斯大學醫院倫理委員會的建議進行的。獲得了兒童監護人的知情同意。

AIH的診斷基於自身免疫性肝炎國際評分標準[9在開始任何免疫抑製劑治療之前進行評估。原發性硬化性膽管炎或重疊綜合征患者被排除在研究之外。

所有納入的患者都接受了適當的病史記錄和徹底的臨床檢查

對所有患者進行實驗室檢查，包括全血計數、血清ALT、AST、總膽紅素、直接膽紅素、凝血酶原時間、血清白蛋白和血清蛋白電泳。

-對所有患者進行腹部超聲檢查，19例患者進行肝活檢進行初步評估，6例患者在開始治療和出血情況穩定後進行肝活檢。

-序列特異性寡核苷酸探針(SSOP)技術HLA-DRB分型，從每位患者的無菌EDTA試管中采集5ml血液。使用DNA分離試劑盒(小型試劑盒，Qiagen, Hilden Germany)進行DNA提取。HLA-DRB分型使用Dynal RELITM SSO HLA-DRB分型試劑盒(Dynal Biotech Ltd.， UK)完成。

該原則基於三個主要過程:

1) PCR擴增反應，利用生物素化引物利用熱循環器產生擴增的生物素化DNA序列，稱為擴增子。PCR采用以下協議:95度變性15秒，引物60度退火45秒，72度延伸15秒。這個過程重複了35個周期。2)雜交步驟，將擴增子進行化學變性，形成單鏈DNA，將其添加到含有固定序列特異性寡核苷酸(SSO)探針陣列的尼龍膜上。生物素標記的擴增子然後結合(雜交)到那些含有互補目標序列的SSO探針上，從而“捕獲”到膜條帶上。3)用比色法檢測擴增子-探針配合物。使用Dynal RELITM SSO模式匹配程序對結果進行解釋[10］．

將我們患者的HLA分型與一項發表的研究進行比較哈利勒等［11該研究在Ain Shams大學專科醫院進行，該醫院使用序列特異性寡核苷酸探針(SSOP)技術對548名埃及人進行了埃及人群中最常見的HLA-DR等位基因調查。使用不同研究的對照被認為是一個弱點，但由於該院是轉診中心，納入的受試者代表了我國的正常人群。

“完全緩解”指的是症狀消失，血清ALT或AST、膽紅素和免疫球蛋白值在1年內恢複正常，或肝活檢組織學改善到正常或最小炎症活性。“治療失敗”的定義是:盡管進行了強化治療，但患者的臨床狀況、實驗室檢查或組織學特征惡化。“對治療的不完全反應”被定義為改善不足以滿足緩解標準[9］．

統計方法

采用SPSS統計軟件包進行數據分析。定量數據用Mean±SD表示，分類數據用個數和百分比表示。兩種獨立的參數數據方法之間的比較采用學生檢驗。兩組獨立的非參數數據比較采用Wilcoxon秩和檢驗。Wilcoxon符號秩檢驗用於非參數數據的兩個相關組之間的比較。卡方檢驗用於研究兩個變量之間的聯係，或對分類數據進行兩個獨立組之間的比較。誤差概率為0.05被認為是顯著的。

AIH患兒中女性17例(68%)，男性8例(32%)，年齡6 ~ 18歲，平均13.2±3.8歲。平均病程4.4±3.1年。

臨床、生化和組織學特征報告在(表1)．我們所有的患者在出現症狀時都有症狀，最常見的發病類型是伴有膽汁淤積性黃疸和肝酶升高的急性肝炎(64%)，而36%的患者出現慢性肝硬化和門脈高壓。在68%的ANA和/或ASMA陽性檢測的兒童中，1型AIH占主導，而2型AIH的特征是存在抗LKM，隻有20%的兒童和12%的血清陰性，根據自身免疫性肝炎的國際評分標準，診斷明確的兒童為88%，可能為12%。20例兒童中有3例(15%)同時發生自身免疫性甲狀腺炎，接受甲狀腺自身抗體檢測。

在我們的患者中，有近四分之一的患者在一開始就有急性肝炎的照片，經甲肝IgM陽性診斷為甲肝。由於這些患者的甲肝病程異常延長(超過一個月)或延長，根據國際自身免疫性肝炎組織的係統，診斷為AIH。他們都患有1型AIH。其餘患者接種疫苗或HAV IgM陰性。

肝活檢顯示92%的患者有嚴重炎症，72%的患者有纖維化，32%的患者有明顯的肝硬化。

64%的納入兒童獲得了完全緩解，28%的兒童隻能獲得部分緩解，沒有人表現出緩解失敗，但8%的兒童對治療不依從。

患者組中最常見的II類等位基因為HLA-DRB1*13，占36%，其次為HLA-DRB1*04(18%)， HLA-DRB1*03(14%)。對照組中出現頻率最高的等位基因為HLA-DRB1*03(19%)，其次為HLA-DRB1*13和HLA-DRB1*04，各占16%。在我們的AIH患者中，隻有HLA-DRB1*13顯著流行2)．

盡管HLA-DRB1*13是2型AIH中最常見的等位基因，但統計上HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*15等位基因在2型AIH中明顯比1型AIH中更常見(表1)3.)．評分係統可能診斷為AIH的患兒1例HLA-DRB1等位基因為3/13,2例為4/13,3例為1/13，與確診患者無差異。

在本研究中，HAV IgM陽性的自身免疫性肝炎患者中HLA-DRB1*13是最常見的等位基因，但與甲肝IgM陰性的患者相比，HLA-DRB1*12是這些患者中唯一具有統計學意義的等位基因，其他等位基因沒有發現顯著差異(表2)4)．

雖然HLA-DRB1*03常出現在對治療的部分應答者中，HLA-DRB1*04常出現在完全應答者中，但這並不具有統計學意義，其他HLA-DRB1*亞型也不具有統計學意義。

自身免疫性肝炎是一種病因不明的慢性肝炎，以免疫和自身免疫特征為特征[12］．基於高分辨率dna的技術表明，自身免疫性肝炎的主要易感因素與ASMA和ANA的表達有關DRB1基因(13］．

有大量證據支持甲型肝炎病毒(HAV)作為AIH的病因因素。這包括持續性肝髒炎症的個別病例報告，經證實感染甲型肝炎後出現AIH的血清學和組織學特征，以及在甲型肝炎感染期間和之後出現針對肝髒成分的自身抗體[14］．

本研究的目的是確定HLA-DRB1在自身免疫性肝炎患者中作為發生危險因素的頻率、其與先前HAV感染的關係以及治療結果。

1型AIH是世界範圍內最常見的AIH，而2型AIH主要發生在兒童和歐洲[15］．然而，在我們的研究中，盡管是在兒童身上進行的，68%被歸為1型AIH, 20%為2型AIH。這個不同意Muratori等［16他發表了意大利博洛尼亞自身免疫性肝炎的經驗，並報告說，在28名納入的兒童中，24人患有2型AIH，但這可以由不同的種族背景來解釋。

在我們的64%的患者中，疾病表現為急性，表現為急性肝炎的體征和症狀，而在其餘36%的患者中，表現為明顯的慢性肝病和門脈高壓。

在不同的研究中，呈現模式有很大的不同Mieli-Vergeni和Vergani［17]報告說，該病的病程可能隨發作和自發緩解而波動，這種模式可能導致延遲轉診和診斷。Kogan等［18]發現34%的患者在出現症狀時無症狀，通常是在常規常規體檢中發現的，包括肝髒測試的篩選和Muratori等［16]的研究發現，42.8%的兒童患者表現為急性肝炎，14%的患者無症狀，7.2%的患者發病隱匿。在我們的研究中，有症狀的患者比例較高，這可以解釋為所有納入的患者都是從轉診中心招募的，因此他們可能代表那些病情更嚴重的患者。

在接受組織病理學活檢的患者中，32%的肝活檢顯示肝硬化，72%的肝纖維化。法拉利等［19]指出，四分之一的患者在診斷時存在明顯的肝硬化，這表明該疾病有持續數月甚至數年的亞臨床表現。

在我們的患者中，有近四分之一的患者一開始表現為急性甲肝，表現為甲肝IgM陽性，根據臨床病程和國際自身免疫性肝炎組織的係統，這些患者被診斷為AIH。與甲肝IgM陰性患者相比，這些患者HLA-DRB1*12等位基因差異有統計學意義，其他等位基因差異無統計學意義，但數量較少，尚待進一步證實。

人們的注意力集中在感染性顆粒和肝髒成分之間的分子擬態理論上，由此產生的抗體會對其產生反應。病毒和肝髒表位之間的這種擬態已被證實[20.］．在AIH患者的親屬中，Vento等艾爾［21]證明了抑製-誘導t細胞介導對肝髒抗原的免疫反應性的內在缺陷(asialoglcoprotein receptor-ASPGR)，並描述了亞臨床暴露(血清轉化為HAV)後AIH的發展，同時抗asgpr抗體上升。Urganci等［22報告一例6歲男童在甲肝病毒感染後並發自身免疫性肝炎和自身免疫性溶血性貧血Tabak等［23]報道了1例急性HAV轉為AIH的21歲女性患者，認為HAV與AIH的長期感染不僅會相互觸發，還會導致肝髒組織的惡化。

然而，這提出了甲型肝炎疫苗是否有能力保護基因易感患者(其他家庭成員)免受自身免疫性肝炎的發展的問題;貝瑞和Smith-Laing［24]報告了一例甲型肝炎疫苗與自身免疫性肝炎相關的病例，並得出結論，該病例在接種滅活甲型肝炎疫苗後複發，進一步證明甲型肝炎可能引發對肝髒的自身免疫，根據疫苗的安全記錄，不應將其解釋為一種副作用，但揭示了兩種明顯不同的肝髒病理之間的潛在聯係。

HLA-DRB1*13是我們人群中AIH發生的易感等位基因Bittencourt等［25他們發現，AIH的遺傳易感性與HLA- drb1 *13有關，但在巴西人群中也發現了HLA- drb1 *03等位基因，這表明不同的HLA抗原會導致AIH I型和II型的易感性。在高加索患者中，攜帶HLADR3和DR4的患者獨立易感AIH，而DR4在日本患者中占主導地位，沒有攜帶DR3的日本患者[26］．

Fainboim和同事［27]指出，HLA DRB1*13是南美1型AIH的危險因素，HLA DRB1*03和DRB1*04是北美白人AIH的獨立危險因素。此外，他們還指出，HLADRB1*13與病毒感染的清除和針對病毒蛋白的免疫反應有關。它的存在可能選擇個體長期接觸有利於疾病發展的病毒和肝髒抗原。在巴西和阿根廷，HLA DRB1*13與1型自身免疫性肝炎的主要關聯表明，HLA DRB1*13有利於觸發抗原的呈現，這些抗原在這一地區是常見的，而甲型肝炎病毒可能是幾種這樣的因子之一，這可能可以解釋我們的孩子中1型AIH的流行，而不是2型AIH，因為我們也是甲型肝炎的流行地區。

根據HLA-DRB1*， AIH治療的部分應答者和完全應答者之間無統計學差異。然而Montano-Loza和同事［28]發現，在確診為I型自身免疫性肝炎的患者中，常規皮質類固醇治療期間的惡化很少發生。治療失敗與早期發病、急性表現、高膽紅素血症和HLA-DRB1*03相關。Muratori等［16]發現I型和II型AIH是同一種疾病，在男性和女性患者中具有相似的特征，HLA-DRB1*04陽性的患者更容易實現完全緩解。持續服用低劑量類固醇是維持緩解的必要條件，可顯著降低疾病進展的風險。

本研究認為HLA-DRB1*13可能是本人群自身免疫性肝炎發生的易感等位基因。HLA-DRB1*07和HLA-DRB1*15可能是自身免疫性肝炎2型發生的易感等位基因。HLA-DRB1*12與甲型肝炎患者AIH的相關性有待進一步研究。

AE:埃及開羅Ain Shams大學兒科和兒科肝病助理教授;R E:埃及開羅Ain Shams大學兒科講師;A:臨床病理學助理教授，埃及開羅Ain Shams大學;兒科碩士學位。

作者和聯係

1. 埃及開羅艾因·沙姆斯大學醫學院兒科

   Amel AM Elfaramawy, Reham M Elhossiny & Heba M Abdel Aziz

2. 埃及開羅艾因·沙姆斯大學醫學院臨床病理科

   阿瑪爾一個阿巴斯

相應的作者

對應到阿梅爾是Elfaramawy．

相互競爭的利益

發件人聲明，他們沒有得到任何支持來源，包括製藥和工業支持或任何組織的任何資金。

作者的貢獻

AE:構思、設計研究，兒童人口學和臨床資料的收集，數據的分析和解釋，起草和修改稿件，R E:數據的獲取，幫助兒童人口學和臨床資料的收集並參與修改稿件，A A:開展實驗室研究，H A:幫助兒童人口學和臨床資料的收集參與起草。所有作者閱讀並批準了最終稿件。

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