小說mutatıons recombınase-activating基因1和不同臨床表型缺陷

背景

重度聯合免疫缺陷症是異質群體內的遺傳缺陷在T -和/或細胞的發展。基因突變在recombinase-activating 1或2 (RAG1/2)代表大約10%的所有SCID病例。RAG1/2至關重要的V (D) J重組B和t細胞受體。

目標

本研究的目的是審查臨床、免疫和分子發現土耳其SCID RAG1缺陷和患者關注小說突變,genotype-phenotype相關性和卡介苗感染的高速率在這個組。

方法

11個病人(F / M: 6/5)。分子生物學、免疫學和臨床數據進行評估。

結果

五個病人分為T-B-NK + SCID, 4名患者當T + B-NK + SCID(兩個病人被診斷為古典Omenn綜合征)和兩個病人T + B + NK + SCID臨床表現和免疫數據。整個學習小組的平均年齡,平均年齡在出現症狀,平均年齡在診斷是:33.0±42.8,3.1±3.3,10.4±13.5個月,分別。血親率為54%。一些小說在RAG1基因突變被發現除了之前報道的突變。Genotype-phenotype相關性沒有明顯明顯的在大部分的情況下。卡介苗感染中觀察到36.4%的患者(兩個BCG-osis和兩個BCG-itis)。

結論

表觀遺傳因素,如複合遺傳缺陷,環境因素,暴露在複發性感染可能修改抹布缺陷的表型特征。等活疫苗接種BCG應該推遲直到排除原發性免疫缺陷病疑似病例合適的篩選試驗。

嚴重聯合免疫缺陷(SCID)症狀接受共同的表型的一係列遺傳疾病(1]。根據最近的免疫和基因的發現,SCID可以細分為11的條件。這些條件異常增加細胞凋亡的淋巴細胞(網狀發育不全造成的腺苷酸激酶2 (AK2) adenosine-deaminase-deficiency),缺陷的細胞因子信號(x連鎖SCID、IL7-receptor-αJAK3 -不足),t細胞受體缺陷(TCR)組裝和信號(RAG1/2 DNAPKcs,阿爾忒彌斯和它,CD3缺陷)和一般t細胞信號缺陷與鈣release-activated Ca + +渠道(堅固)而非機密的缺陷,如RNA組件的缺陷線粒體RNA加工的內切核糖核酸酶(RMPR)也稱為Cartilage-Hair-Hypoplasia [2- - - - - -4]。

突變基因重組酶激活1或2 (RAG1/2)代表大約10%的所有SCID例(5]。這些基因位於human11p13染色體。他們的產品;RAG1和RAG2蛋白質必不可少的V (D) J重組B (BCR)和細胞在T細胞和B細胞發展(6- - - - - -8]。

第一RAG1基因的突變被發現在1996年由施瓦茲et al (9]。完整的破布不足(RAGD)沒有V (D) J重組活動(< 1%野生型)與古典SCID和缺乏T細胞和B細胞。據估計,RAG1/2參與大約50%的患者T-B-NK + SCID表型(10]。與殘餘RAGD V (D) J活動野生型重組活動(> 1%),描述了臨床及免疫學亞型;如RAGD皮膚炎症和αβt細胞擴張(古典Omenn綜合征),RAGD皮膚炎症和沒有t細胞擴張(完整Omenn綜合征),RAGDγδt細胞擴張和RAGD肉芽腫(2,3,11]。B細胞水平和免疫球蛋白濃度幾乎是正常或略減少患者hypomorphic突變(12]。在最近的研究中,自體免疫血球減少和抗巨細胞病毒感染報告hypomorphic抹布突變患者(12- - - - - -14]。這些患者通常伴有嚴重和致命的細菌,病毒和真菌感染在早期階段不管SCID類型和潛在的遺傳缺陷。一些抹布缺乏症患者可能出現在以後的生活中與肉芽腫形成聯合免疫缺陷(15]。SCID患者同時伴有分枝杆菌物種的機會性感染和並發症後接種卡介苗(BCG)。

本研究的目的是審查臨床、免疫和分子發現土耳其SCID RAG1缺陷承認兒科患者免疫學部門在西部地區和關注小說突變,genotype-phenotype卡介苗感染的相關性和高頻率。

病人

11 SCID的診斷患者對嚴重的上、下呼吸道感染從2002年到2010年,針對大學醫學院兒科學係免疫學、伊茲密爾,土耳其;綜述了在這個研究。評估表被用來總結病人的人口統計信息包括姓名、性別、出生日期、年齡出現症狀,臨床症狀,診斷年齡,家族史和血緣關係,之前的藥物和疫苗接種史,和實驗室和分子數據。患者根據臨床和實驗室診斷和分類標準的SCID iui報道原發性免疫缺陷(專家委員會16]。

所有患者的突變篩查RAG1, RAG2基因。十的同齡,健康人(平均年齡:27.4±2.1年)擔任控製基因數據的分析。本研究針對大學倫理委員會批準,每個參與病人的知情同意了。

細胞和免疫分析

完整的血細胞計數外周血塗片評估、血清免疫球蛋白的濁度測定法(戴德貝林BNII濁度計分析儀、德國),以前的疫苗的抗體反應,淋巴細胞表現型(T、B、NK細胞)流式細胞儀(美國正欲FACSCalibur)的標準進行實驗室調查我們的病人。

臨床樣本和DNA隔離

外周血樣本來自靜脈穿刺的患者。從血液樣本中提取基因組DNA隨後使用標準技術(17]。

RAG-1和RAG-2位點突變分析

由於限製的表達RAG-1和RAG-2基因和每個基因的編碼區是包含在一個外顯子,編碼序列從基因組DNA被放大。引物設計的放大破布基因序列的基礎上報告數據庫(RAG-1M29474;RAG-2M94633)。破布正如前麵指定[獲得了基因序列信息18]。或者,RAG-1基因是放大2段(94 - 1852和1781 - 3262年),和RAG-2基因是放大一個段(1201 - 2922)以下引物:RAG-1-90 F, CTG AGC亞美大陸煤層氣有限公司俠盜獵車手有條件現金援助CAG C;RAG-1-1852 r, GCC TTC CAA手槍GTC TTCTTC;RAG-1-1781 F, GCAAAG gg TTC公司治理文化答GA;RAG-1-3262 r,貓亞美大陸煤層氣有限公司TGG TTG CCC TAC TT;RAG-2-1201 F, ATG TCT CTG CAG ATG俠盜獵車手交流;RAG-2-2922 r, CTG GCC CTT AAT檸檬酸TGT AAC。直接測序進行PCR產物純化從凝膠Thermosequenase工具包(Amersham法瑪西亞生物技術,英國白金漢郡,英國)。為患者複合雜合的,突變被證實通過限製分析或幾個克隆PCR擴增分析產品在TA向量(表達載體)和克隆測序的dideoxynucleotide鏈終止法使用Sequenase工具包(USB),如前所述[18]。

使用SPSS統計分析(Windows版本15.0,SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

11例(F / M: 6/5)和SCID Omenn綜合症曾破布變異進行了分析。他們的人口統計結果表中列出1。其中,兩個曾被報導過14]。五個病人分為T-B-NK + SCID, 4名患者當T + B-NK + SCID(兩個病人被診斷為古典Omenn綜合征)和兩個病人T + B + NK + SCID臨床表現(表1(表)和免疫數據2)。整個學習小組的平均年齡,平均年齡在出現症狀,平均年齡在診斷;33.0±42.8,3.1±3.3,10.4±13.5個月,分別。血緣關係是存在於6(54%)的11病人和他們都是二級的親戚。陽性家族史的免疫缺陷確定五個病人(45%)。

絕對淋巴細胞計數和淋巴細胞分布子集RAGD患者如表所示2。淋巴細胞減少是記錄在所有患者的36%(80%的T-B-NK + SCID的病人,和25%的T + B-NK + SCID病人)。高可變性的淋巴細胞總數是記錄在這些組。數據的表達激活標記(HLA-DR)獲得的子組RAGD SCID的病人。特別是,T + B-NK +集團HLA-DR +細胞百分比增加(100%)。兩組(T + B -和地震遙測+)的患者RAG1缺陷CD19細胞的比例非常低。患者NK細胞比例最高的是地震遙測- SCID (73.2%)。嗜酸性粒細胞,Omenn綜合症的一個著名的特性,在2/4 T + B-patients集團,在地震遙測的1/5 -病人和1/2 T + B +的病人。沒有一個病人已被證明產生特定抗體疫苗、破傷風類毒素等B型流感或乙型肝炎。

Genotype-phenotype相關性

我們調查了RAG1和破布2的突變基因在SCID患者和對照組(表2)並把他們與臨床表型。以下11 SCID患者的研究結果發現:

兩個小說在4名患者的突變

純合子突變的p.R394Q / p.R394Q被發現在三個地震遙測-組的病人(病人1 - 2 - 5)。兩個病人和他們的父母(沒有。1和5)是表兄弟。淋巴細胞減少、低丙球蛋白血症、早發性疾病的症狀是重要的在這三個病人。

另一個突變之前並沒有報道的,在地震遙測- SCID集團p。R776Q, 3047 - 3049 del GCC(病人3)。這名女病人慢性腹瀉從新生兒期開始。其他臨床發現肝腫大,脾腫大,皮炎,肛裂,未能茁壯成長。直接庫姆斯測試是積極的。除了慢性肺部感染,觀察淋巴結病在胸腔的電腦斷層攝影術和腋窩區域。分枝杆菌bovinum被發現在她的痰和後,她開始接受抗細菌治療卡介苗感染的診斷。

兩個之前報道的突變兩個病人

純合子突變的Q248X在我們Omenn綜合症患者(9)已經被報道在T-B-NK + SCID Omenn綜合征病例。類似於以前報告的病例中,P85fs32X (del A256 / A257)突變被發現在一個漏水的SCID患者(病例11路)。這種情況下有耐火巨細胞病毒感染、自身免疫和高γδT細胞。

氨基酸的變化:突變或多態性?(五個病人)

p.H249R氨基酸變化(純合子)中檢測出T-B-NK +病人(4),他承認在40/365一天因為肺部感染、念珠菌病和接受BMT當他三個月大。

p.H249R氨基酸變化(雜合的)中觀察到的兩個我們的箱子(患者8和10),一個Omenn綜合症和一個T + B + SCID。Omenn綜合症病例都經典的臨床和實驗室研究結果。他早發性廣義紅皮病,未能茁壯成長,長期腹瀉,肝脾腫大,淋巴結病、嗜伊紅血球過多。這種情況下了左腋窩淋巴結病六周後卡介苗感染。分枝杆菌bovinum被孤立於淋巴結(BCGitis)。其他情況T + B + SCID反複肺感染,脾腫大和巨細胞病毒感染。她收到了卡介苗在SCID的診斷和發展雙邊腋窩淋巴結病疫苗接種後三個月內。肉芽腫性淋巴腺炎在淋巴結活檢和觀察分枝杆菌bovinum被隔離(BCGitis)。分析這兩個病人的父母透露,母親也有同樣的發現。

p.H249R / p.K820R氨基酸的變化(複合雜合的)被觀察到在兩個病人的T + B -組。男性的情況(7)患者有腹瀉,複發性細支氣管炎和自身抗體。幾個結節被觀察到在他的肩膀和臀部區域當他是三歲。分枝杆菌Bovinum被隔離來自結節活檢和支氣管肺泡灌洗液(BCGosis)。女性的情況(病人6)反複肺感染,腹瀉,肝腫大,脾腫大,支氣管擴張,。她現在13歲,接受常規靜脈注射免疫球蛋白治療。

突變或氨基酸變化尚未觀察到的健康對照組。沒有破布2基因突變患者或對照組。

RAG1base和RAG2base突變數據庫

所有報告RAG-1突變被記錄到數據庫RAG1基地和RAG2基地。這些數據庫是根據構造http://www.uta.fi/imt/bioinfo/RAG1base和/ RAG2base。

死亡和生存

五個病人接受了骨髓或umblical臍帶血幹細胞移植(BMT)。這些病人收到兄弟的骨髓(n = 1),同一性的母親(n = 2)(病人11 2 bmt),同一性的父親(n = 1)和匹配(n = 2)捐助者無關。移植後平均隨訪時間為9.0±8.9個月。兩個病人死亡4例患者移植後死亡移植前在隨訪中。移植並不是實現兩種情況。其中一個是一個T + B + NK +漏水的SCID男性患者和供體是他的母親,和另一個病人T-B-NK +患者和供體是他的哥哥。一個病人(T + B + NK +漏水的SCID女病人)BMT後已經完全恢複。兩個病人正在其次是預防性丙種球蛋白替代和他們正在等待匹配的無關供者篩選的結果。

突變RAG1或RAG2代表大約10%的SCID病例和大多數T-B-NK + SCID [16]。為我們的病人,T-B-NK +的頻率,T + B-NK T + B + +和NK + SCID表型是45%,36%和18%,分別。我們所有的病人早日實現SCID之前定義的臨床標準。血緣關係(54%)和家族史為免疫缺陷(45%)是很高的在我們的病人組。近親婚姻率高(21%)在土耳其是一個社會和健康問題的一些傳統概念,尤其是在東部地區。女性/男性比例是1.2。由於這些發現,consanquinity率高的影響,RAGD之前報道的是在一個常染色體隱性遺傳模式(18- - - - - -20.]。

到目前為止,至少55個不同hypomorphic抹布突變被描述;然而,明顯的突變類型與臨床表現之間的相關性並沒有被觀察到。這可能是由於特定的突變或其他遺傳因素,或表觀遺傳機製。確定的突變,RAG1和RAG2基因;可以嚴重,導致無效等位基因,或輕微,導致hypomorphic等位基因仍然可以保持殘餘RAG1/2蛋白質的酶活性。在古典T-B-SCID零突變體通常占主導地位,沒有生產重排的T細胞受體(TCR)或b細胞受體(BCR);錯義突變支配在Omenn綜合症和漏水的SCID [21,22]。相同的變異在不同的個體通常導致相似的表型。也有一些情況下,相同的突變產生不同的臨床表現。這表明,未知因素可能扮演一個角色在決定臨床情況和結果21- - - - - -25]。

hypomorphic突變P85fs32X (del A256 / A257)(舊的命名法k242fsX246 del A368 / A369),展示了在我們的十一病人,被別墅et al(之前報道13]。在另一份報告由de Villartay et al,四無關的病人,用同樣的hypomorphic RAG1突變了(26]。Villartay等免疫表型的患者包括限製T細胞,與TCR <β淋巴細胞減少,但明顯高水平的TCRγ™T細胞。嚴重,傳播巨細胞病毒感染和自身免疫性血細胞表現形狀的臨床表型。我們相同的hypomorphic突變幾乎相同的患者的臨床和實驗室研究結果,顯示一個明確的基因型和表現型之間的相關性,這四個病人。

Sobacchi et al (2]報道24 RAGD病例和16 2006年小說突變。這份報告是一個突變的p.Q248X純合子突變觀察T-B-SCID案例。我們的病人(9)有著同樣的突變的特征發現Omenn綜合症。Asai et al最近報道(2011)4錯義和1無意義突變RAG1 SCID三個孩子(27]。孕產婦T細胞非典型SCID情況engrafment純合子的小說E770K突變(27]。1例非典型Omenn綜合症是複合雜合的軸承的小說R142X和R396H突變(27]。最後情況γδT -巨細胞病毒感染是一個複合雜合子軸承小說R474C和L732F突變RAG1 [27]。我們的情況下沒有攜帶這些突變。

Pico-Knijnenburg et al (28)報道,一個家庭有三個兄弟姐妹的人被感染的早期發病,肺炎、敗血症、廣義性皮炎,營養不良和腹瀉。有一個強大的T細胞和B細胞的減少和一個完整的塊前體B細胞分化的骨髓顯示V (D) J重組缺陷(28]。在所有兄弟姐妹,一個雜合的突變RAG1被確定(c2571A > G;p.Cys328Tyr) [28]。他們認為,以防RAG1的雜合突變的基因,可能有另一個缺陷在第二個等位基因,並沒有拿起與常規方法如PCR和測序的編碼區。在她的患者群,別墅也觀察到Omenn情況下攜帶突變等位基因隻有一個,沒有突變或其他基因啟動子區域VDJ重組(個人溝通)。根據小心她,單核苷酸多態性(SNPs)分析也將有助於澄清這些病人的缺陷。

H249R(一個純合子和兩個雜合的病人在我們的研究)K820R(兩個複合雜合的患者)變異曾被觀察到在我們的病人組中,但不是在我們小健康對照組。Notarangelo LD(美國波士頓兒童醫院)已經發現了幾個正常人與這些變異,他認為他們不能disease-causing-polymorphisms,(個人溝通)。我們五個病人出現經典跡象,症狀和實驗室發現SCID和對照組的分子分析包括10人。因此,我們建議未來研究披露人類破布突變體的功能活動會告訴我們如果這些疾病導致或多態性變異。此外,分析了至少一百名健康土耳其RAG1基因的人會讓我們更了解這些變化的疾病活動。

高頻卡介苗感染在我們的研究中還需要討論。Yeganeh等報道,複雜的卡介苗(BCG)疫苗接種記錄在40 SCID 18例(45%)常規疫苗接種後出生時(29日]。在另一項研究中,嚴重不良反應的發生率BCG接種疫苗後報告為每100000人0.0182例在日本兒童接種疫苗。在39例不良反應,13被診斷有某些類型的原發性免疫缺陷。四人SCID [30.]。Sadeghi-Shanbestari M et al (31日)報道,七的十一播散性感染和原發性免疫缺陷患者SCID病例。從這七個SCID和卡介苗感染情況下,四個病人T-B-NK + SCID;可能破布相關基因(31日]。相同的作者也報道小說RAG2 SCID和BCG疾病患者的突變(32]。我們的11 RAGD 4例(36.4%)有BCG疾病(2 BCG-itis和2 BCG-osis),不得不接受anti-mycobacterial療法。患者的臨床結果和管理記錄卡介苗感染比我們組的其餘部分。

我們從這個審查得出幾個結論RAGD病人:

複合遺傳缺陷等表觀遺傳因素,環境因素和接觸傳染性病原體可能修改RAGD的表型特征。純合子突變的p.R394Q / p.R394Q和p。R776Q, 3047 - 3049 del GCC突變是小說和它們造成嚴重T-B-NK + SCID。

是非常重要的提高兒科醫生的意識對於早期診斷和治療這些患者的破布的缺陷。

等活疫苗接種BCG應該推遲疑似病例的主要免疫缺陷疾病,直到合適的篩查排除此診斷。因此,知識之前的情況下與免疫缺陷在同一家庭有利於早期診斷和決定推遲BCG在這樣的病人。

這項工作在一定程度上支持從迪拜哈佛基金會的資助醫學研究(DHFMR)。我們要感謝路易吉·d·Notarangelo博士和羅孚格哈出色的支持。

作者和聯係

1. 針對大學醫學院兒科學係,35100年,Bornova,伊茲密爾,土耳其

   Necil Kutukculer, Nesrin Gulez, Neslihan愛德Karaca, Guzide阿克蘇& Afig Berdeli

相應的作者

對應到Neslihan愛德Karaca。

相互競爭的利益

作者宣稱沒有利益衝突。

作者的貢獻

AB進行分子遺傳學研究。NG和山峽回顧了數據和寫論文。NK和GA手稿和編輯的數據分析。所有作者閱讀和批準最終的手稿。

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再版和權限