哺乳期母-新生兒血清維生素D及維生素D結合蛋白水平的研究

背景

縱向測定母新生兒組血清25-羥維生素D(維生素D)和維生素D結合蛋白(DBP)水平的關係，評價泌乳45 ~ 60天預防性維生素D的有效性。

方法

將產後5 ~ 10天血清鈣(Ca)、磷(P)、鎂(Mg)、堿性磷酸酶(ALP)、甲狀旁腺激素(PTH)水平在正常範圍內的新生兒對按血清維生素D濃度分為兩組(A組< 10 ng/ml, B組> 20 ng/ml)。A組和B組產婦和新生兒Ca、P、Mg、ALP、PTH濃度無差異。測定兩組產婦和新生兒血清DBP水平。兩組母新生兒均口服維生素d 400 IU/d。A組在泌乳期第45 ~ 60天重新測定相同的生化指標。

結果

與B組相比，A組產後/產後5 ~ 10天產婦和新生兒平均維生素D水平顯著降低，DBP水平顯著升高(P= 0.000;P= 0.000,P= 0.04;P分別為= 0.004)。哺乳期45 ~ 60天，產婦和新生兒DBP濃度與產後5 ~ 10天無差異。然而，產婦和新生兒的維生素D水平顯著增加(P= 0.000,P= 0.000)，而新生兒甲狀旁腺素濃度顯著降低(P= 0.000)。產婦和新生兒維生素D濃度與其DBP濃度呈負相關(P= 0.048,P分別為= 0.002)。

結論

高的產婦和新生兒DBP水平可能導致對維生素D真實濃度的錯誤低估。在這種情況下，母親和嬰兒隻需要服用預防性維生素D (400 IU/ D)。

越來越多的報告表明，在許多發達國家和發展中國家，來自不同日照地區的孕婦及其新生兒維生素D缺乏症非常普遍[1］．在這些研究中，維生素D缺乏症的患病率在18%至84%之間[1］．然而，這些數據通常僅基於血清25-羥維生素D(維生素D)濃度，而不考慮血清鈣(Ca)、磷(P)、鎂(Mg)、堿性磷酸酶(ALP)和甲狀旁腺激素(PTH)水平，孕婦及其新生兒都是如此。因此，它們可能不能反映真實的維生素D狀況。

維生素d結合蛋白(DBP)是一種多功能、高表達的血漿蛋白。DBP的主要功能之一是結合和運輸主要循環代謝物維生素D和1,25-二羥基維生素D(活性維生素D) [2］．許多生理和病理因素可影響血漿DBP水平[3.］．懷孕已被證明與血清DBP水平的升高有關。這種情況是由雌激素刺激DBP合成引起的[3.］．妊娠期在雌激素作用下的高DBP濃度可能是孕婦及其新生兒中維生素D濃度低的原因，因為它與維生素D結合。據我們所知，此前沒有縱向研究調查哺乳期母親及其新生兒血清維生素D與DBP之間的關係。

研究目的

我們假設，較高的產婦和新生兒DBP水平可能導致對真實維生素D水平的不正確的低估計，預防維生素D劑量(400 IU/ D)對於這些母親和她們的嬰兒在哺乳期早期是足夠的。因此，本研究的目的是評估母親及其新生兒血清維生素D與DBP水平之間的關係，並評估45-60天哺乳期間預防性維生素D的有效性。

主題

阿塔圖爾克大學醫學院倫理委員會批準了這項研究。獲得所有參與者的書麵知情同意。該研究是縱向的，在2013年至2016年的冬季和春季進行。在哺乳期的前60天，觀察母鼠及其新生兒血清維生素D和DBP濃度。首先，這些母親是從土耳其埃爾祖魯姆阿塔圖爾克大學醫學院產科和婦科係中挑選出來的，該大學為400多萬人提供三級保健服務。排除標準為多胎、不同種族、前2年分娩、母體疾病、先兆子癇、入組時BMI > 35.0、高血壓、吸煙、激素或藥物治療、哺乳期失敗。其次，對符合研究標準的產婦的新生兒進行評估。入選標準為無並發症妊娠後足月分娩的適宜胎齡(AGA)新生兒。孕齡大(LGA)或孕齡小(SGA)、有任何胎兒畸形、補充配方奶粉和隨訪2失敗的新生兒與其母親一起被排除在研究之外。然後，在產後5 ~ 10天測量入選研究的母親血清Ca、P、Mg、ALP、PTH和維生素D濃度。 The mothers having normal serum Ca (8.8–10.8 mg/dl), P (2.7–4.2 mg/dl), Mg (1.2–1.6 mg/dl), ALP (130–560 IU/l), and PTH (1–55 pg/ml) were classified into two groups by their serum vitamin D concentration (Group A: < 10 ng/ml and Group B: > 20 ng/ml), whereas those whose serum vitamin D concentration was 10–20 ng/ml were excluded from the study. Finally, the same biochemical markers in the neonates of the mothers included in the study were measured on postnatal days 5–10. Among the neonates having normal serum Ca (7.6–11.2 mg/dl), P (4.8–8.2 mg/dl), Mg (1.2–1.6 mg/dl), ALP (140–450 IU/l), and PTH (1–43 pg/ml), those having similar vitamin D concentrations as their mothers were included the study, whereas those whose serum vitamin D concentration was 10–20 ng/ml were excluded from the study together with their mothers. The mean maternal and neonatal serum Ca, P, Mg, ALP, and PTH concentrations in group A and B were not significantly different (Tables1而且2)．最初選取了200 53名母親，但其中99人根據臨床和實驗室結果被排除在研究之外。在剩餘的154對母-新生兒中，53名符合排除標準的新生兒與其母親一起被排除在研究之外。剩下的101對母新生兒符合研究標準。然而，41名新生兒被排除在研究之外，原因如下:10名在隨訪期間沒有來看望2名，10名必須使用配方奶粉，14名停止維生素D預防，7名血清維生素D濃度與其母親不屬於同一組。因此，這項研究在60對母嬰中完成:A組30對，b組30對。所有的母親和她們的新生兒都給予口服預防性維生素D補充劑400 IU/ D，因為血清維生素D本身不足以診斷維生素D缺乏，無論血清Ca、P、Mg、ALP和PTH水平如何。在哺乳期第45天至第60天(來訪2)的任何一天，重新測量A組每對母-新生兒的血清Ca、P、Mg、ALP、PTH和維生素D濃度。在研究開始時采集兩組母-新生兒的血液樣本(2ml)，在來訪2時僅采集A組母-新生兒的血液樣本(2ml)。樣品被放入一個普通的真空玻璃管中。血液樣本在4℃下以3.500 rpm離心5分鍾。將血清移液到Eppendorf管中，保存在- 80°C用於DBP分析。

記錄嬰兒的人體計量學指標和孕周。使用電子秤(Seca Model 770，漢堡，德國)測量重量。長度(±0.1 cm)由兒科醫生用體長計測量。頭圍是用卷尺測量的。

除了母親的年齡和服裝風格(遮蓋:穆斯林風格服裝和不遮蓋)之外，根據母親的自我評估記錄了妊娠期間維生素D補充的時間和劑量以及暴露在陽光下的時間。

生物化學分析

血清樣本在冰箱中保存一夜，以便在分析前解凍。采用Beckman Coulter- AU5800化學分析儀，分光光度法測定血清Ca、P、Mg和ALP水平。采用Beckman Coulter-DXI800分析儀，免疫分析法測定血清甲狀旁腺激素和維生素D水平。我們使用人維生素D結合蛋白試劑盒(人維生素D結合蛋白，DBP ELISA試劑盒，孫龍生物技術有限公司，批號201610)。該試劑盒的靈敏度限為0.01 μg/ml。組內和組間變異係數分別< 10%和< 12%。

統計分析

本研究的總樣本量由以下公式計算。

r是a組(n1)和B組(n2)樣本容量的比值(n1/n2)。我們計劃A組和B組的樣本量相等。因此,r= 1。Z_{α/ 2}和Z_{1 -β}5%顯著性水平為1.96,90%統計力為1.28。δ和d分別表示DBP的合並標準差和均值之差。根據該公式，統計效力為90%，顯著性水平為5%的每組的總樣本量為29。

所有的計算都使用SPSS (Windows版本15.0)進行。正態性采用Kolmogorov-Smirnov檢驗。A組與B組比較采用學生t檢驗和卡方檢驗。用配對t檢驗分析A組血清參數的縱向變化。用Pearson相關係數檢驗兩個變量之間的相關性。結果以均數±標準差表示，統計學顯著性設為P< 0.05。

A組和B組孕婦的平均年齡、服裝風格、孕期維生素D補充劑量無差異，而A組維生素D補充時間和日照時間顯著低於B組(P= 0.001,P= 0.02)(表3.)．A組產婦血清維生素D平均水平顯著低於B組，DBP水平顯著高於B組(P= 0.000,P= 0.04)(表1)．A組泌乳5 ~ 10天產婦血清P、Mg、ALP、PTH、DBP平均濃度與泌乳45 ~ 60天產婦血清P、Mg、ALP、PTH、DBP平均濃度無顯著差異，而血清Ca和維生素D濃度顯著升高(P= 0.000,P= 0.000)(表1)．

A組和B組的孕齡和新生兒出生時的人體測量值無顯著差異(表4)．A組新生兒血清維生素D平均水平顯著降低，而DBP水平顯著升高(P= 0.000,P= 0.004)(表2)．A組泌乳5 ~ 10天新生兒血清P、Mg、ALP、DBP平均濃度與泌乳45 ~ 60天差異不顯著;但新生兒血清鈣和維生素D的平均濃度顯著升高，甲狀旁腺素的平均濃度顯著降低(P= 0.000,P= 0.000,P= 0.000)(表2)．

綜合來看，數據顯示產婦和新生兒維生素D濃度與產婦和新生兒DBP濃度呈負相關(r=−0.239,P= 0.048,r=−0.401,P= 0.002)(無花果。1而且2)．

盡管兒童和成人的血清維生素D濃度沒有共識，但血清維生素D水平< 10 ng/ml (25 nmol/l)和20-50 ng/ml (50-125 nmol/l)分別被認為代表維生素D缺乏和充足[4，5，6，7］．根據這些信息，在本研究中，A組和B組分別代表維生素D缺乏和維生素D充足。因為維生素D主要控製飲食中鈣的吸收，所以血清鈣水平，即使在維生素D輕度不足的情況下，也會通過血清甲狀旁腺激素水平的升高來補償，而甲狀旁腺激素水平的升高又與高ALP和低P水平相關[7］．因此，許多研究都利用血清甲狀旁腺激素與維生素D的關係來確定血清維生素D的正常範圍[8，9，10，11］．足夠的血清維生素D水平定義為能使血清甲狀旁腺素濃度維持在正常範圍內的血清維生素D濃度[7］．由於鎂是甲狀旁腺素分泌所必需的，所以血清鎂水平也應正常[12］．在我們的研究中，A組和B組產婦和新生兒血清鎂水平無差異。A組產婦和新生兒血清維生素D水平明顯低於b組，而A組血清Ca、P、ALP和甲狀旁腺素水平無明顯變化。這一發現表明，A組的維生素D缺乏並不是真正的缺乏。換句話說，A組維生素D的生物活性在目標組織水平上是足夠的。自由激素假說認為，蛋白質結合的激素相對不活躍，而未與結合蛋白結合的激素具有生物活性[13］．循環中的大多數維生素D和活性維生素D(85-90%)與DBP緊密結合，而少量(10-15%)與白蛋白結合。血液循環中隻有不到1%的維生素D以自由和遊離的形式存在[14，15］．為了準確測定血清維生素D，維生素D應從白蛋白和DBP中分離出來。然而，從DBP中取代維生素D是一個主要的挑戰。該過程中使用的有機溶劑與大多數免疫測定法或蛋白質結合測定法不兼容[16，17，18］．一項臨床化學研究證實了有效維生素D測定的分析問題[19］．在該研究中，對51名健康個體、52名孕婦、50名血液透析患者和50名重症監護患者的相同血漿樣本進行了五種自動免疫測定法(Architect、Centaur、iSYS、Liaison和Elecsys)、一種RIA (Diasorin)和一種ID-XLC-MS/MS方法的維生素D測定。用ELISA法測定血漿標本中DBP水平。隨著ID-XLC -MS/MS方法被認可為金標準，Architect、Centaur、iSYS和Liaison自動化免疫測定法顯示血清DBP濃度與測定的維生素D濃度與ID-XLC -MS/MS之間的偏差呈反比關係。這一發現表明，這些自動測定不能從血清中的DBP中提取所有的維生素D。這種不完全的提取可能表明維生素D濃度過低。在本研究中，我們使用Beckman - Coulter自動免疫分析法測定血清維生素D水平。這種方法可能導致血清維生素D濃度不正確地低，特別是在存在高血清DBP濃度的情況下，因為它是一種類似於上述研究中的免疫分析方法。在本研究中，母親和新生兒血清DBP與維生素D之間的負相關支持了這一假設。

研究表明，種族和DBP基因型、年齡和性別、懷孕和雌激素狀態、肥胖、肝腎疾病、糖尿病、原發性甲狀旁腺功能亢進、癌症、炎症以及血漿置換和腹膜透析等一些治療程序都可能影響血清DBP和維生素D濃度[20.］．妊娠期舒張壓水平升高是雌激素刺激舒張壓合成的結果[3.，21］．在我們的研究中，母親和他們的新生兒沒有任何障礙。這些母親的種族和年齡都相同。因此，可以說母體和新生兒體內的雌激素是決定血清DBP濃度的主要因素。然而，在我們的研究中，我們發現A組和B組產婦和新生兒血清DBP水平是不同的。這一發現提示除了妊娠期雌激素外，其他一些因素也可能影響血清DBP水平。

在A組隨訪中，產婦和新生兒血清DBP濃度與泌乳5 ~ 10天無差異，而血清維生素D濃度顯著升高。維生素D補充(400 IU/ D)可能是導致這些較高濃度的原因。此外，由於補充維生素D可能隻是將血清維生素D濃度維持在一個類似的水平，我們也可以推測，血清維生素D水平的增加可能與舒張壓長期釋放維生素D有關。

據報道，許多國家的孕婦和新生兒中普遍存在亞臨床維生素D缺乏症。在一項綜述中，有18%的英國孕婦、25%的阿拉伯聯合酋長國孕婦、80%的伊朗孕婦、42%的印度北部孕婦、61%的新西蘭孕婦和60-84%的荷蘭非西方孕婦的血清維生素D濃度均< 10ng /ml [1］．同樣，來自阿拉伯聯合酋長國、伊朗、印度、英國、希臘和美國的研究表明，出生時缺乏維生素D的母嬰比例很高[1］．在這些研究中，維生素D缺乏症的患病率僅基於免疫測定法測定的血清維生素D水平，而不考慮血清Ca、P、Mg、ALP和PTH水平。我們的研究結果表明，即使一對母新生兒的血清維生素D水平低於10 ng/ml，這一發現也不足以診斷維生素D缺乏，無論血清Ca、P、Mg、ALP和PTH水平如何。因此，也可以說，維生素D缺乏症在這些人群中的實際患病率可能較低。

本研究存在以下幾個不足:1)研究對象數量較少，研究力量相對有限;2) B組各生化指標均在正常範圍內。因此，出於倫理原因，他們隻被測量了一次。因此，不能評價B組的生化參數隨時間的變化;3).我們使用自動免疫分析法測定血清維生素D水平，因為隻有血清Ca、P、Mg、ALP和PTH水平正常的母親及其嬰兒被納入研究。但需要強調的是，由於現有維生素D測定方法存在分析問題，LC-MS/MS法也可以測定血清維生素D水平。

本研究首次探討了哺乳期間產婦和新生兒血清維生素D與DBP之間的關係。本研究結果提示，基於正常血清Ca、P、Mg、ALP和PTH水平，孕產婦和新生兒血清DBP水平偏高可能與維生素D濃度偏低有關。即使產婦和新生兒血清維生素D濃度在低血清維生素D水平(< 10 ng/ml)方麵是一致的，如果不考慮血清Ca、P、Mg、ALP和PTH水平，單憑這一發現也不足以診斷維生素D缺乏。血清鈣、磷、堿性磷酸酶和甲狀旁腺激素水平缺乏預期的變化，同時缺乏低濃度的維生素D缺乏症和正常的血清鎂可能是由於測量方法和/或高DBP水平造成的，並不能反映真正的維生素D缺乏症。在這種情況下，母親和嬰兒隻需要服用預防性維生素D (400 IU/ D)。

不適用

資金

這項研究沒有資金支持。

數據和材料的可用性

手稿中描述的可複製材料，包括數據庫和所有相關的原始數據，都可以免費提供給任何希望使用它們的科學家。

作者指出

作者和聯係

1. 25240，土耳其埃爾祖魯姆，阿塔圖爾克大學醫學院小兒內分泌學係

   Hakan Doneray和Zerrin Orbak

2. 土耳其埃爾祖魯姆阿塔圖爾克大學醫學院兒科學

   Remziye Seda Yesilcibik

3. 土耳其埃爾祖魯姆公共衛生實驗室生物化學係

   將有關Laloglu

4. 土耳其埃爾祖魯姆阿塔圖爾克大學醫學院婦產科

   Metin Ingec

貢獻

HD對研究的所有部分和論文的撰寫都有貢獻。RSY參與了數據的統計分析、協調和獲取。EL有助於獲得生化數據。MI協助研究設計並監督研究。ZO參與了手稿的起草和修改。所有作者已閱讀並認可最終稿。

相應的作者

對應到哈坎Doneray．

倫理批準和同意參與

這項研究得到了阿塔圖爾克大學審查委員會的批準。在對所使用的所有程序的目的和性質進行充分解釋後，兒童的父母獲得了知情同意。

同意出版

所有患者的父母均同意發表。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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