基於氣相色譜-質譜分析的早產兒血清代謝分析與壞死性小腸結腸炎的關係:一項橫斷麵研究

背景

早產和喂養是新生兒壞死性小腸結腸炎(NEC)最重要的致病因素。代謝組學已廣泛應用於其他疾病的診斷和治療，但尚未對早產兒相關疾病進行研究。與足月嬰兒相比，早產兒代謝有其特異性，容易導致NEC等消化道炎症性疾病。代謝組學可應用於早產相關疾病的診斷，如NEC。

方法

采用我院19例早產兒血清樣本建立模型，並與足月對照組進行比較。采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析血清，並分析血清代謝特征。投影中重要的變量，P采用SIMCA、SPSS等多元統計分析軟件對各樣本的值和Pearson相關係數進行分析。

結果

與足月嬰兒相比，早產兒血清中木犀草素含量顯著升高，木糖、o -琥珀酰- l-高絲氨酸和月桂酸含量較低。早產相關疾病的幾種不同代謝產物與臨床相關指標(白蛋白、總膽紅素)之間存在一定相關性。

結論

早產兒血清中存在代謝改變，有助於NEC的診斷。

隨著經濟水平的提高和臨床診療準確性的提高，早產兒的生存率不斷提高[1］．但由於早產兒器官和係統發育不成熟，代謝更容易受到內外環境的影響，從而導致各種全身性疾病的發生[2］．其中，NEC是最嚴重的疾病之一。早產是NEC的主要危險因素之一。3.］．NEC患者中早產兒占75-95% [4］．此外，早產兒NEC的死亡率高於足月兒，預後也較差[5］．雖然NEC的治療正在改善，但其死亡率仍然很高。因此，探討NEC的病因、發病機製及早期預防就顯得尤為重要。但是，在早期並沒有具體的指標可以預測NEC的發生。本研究的目的是收集非喂養早產兒血清，利用氣相色譜-質譜聯用分析代謝譜，探討早產兒與足月嬰兒的代謝差異。由於研究結果尚未得到驗證，本研究采用通用篩選的方法選擇與NEC密切相關的代謝物。

臨床數據

從2017年6月至2018年1月(出生月29日)在我院出生的患者中招募了19例^{+ 4}week-34^{+ 3}周，出生體重1.5-2.1 kg)。我們納入了所有符合納入標準的新生兒。NEC診斷采用Bell分期(Bell分期≥1)。診斷NEC的醫生對血清GC-MS檢測結果不知情。獲得家長知情的書麵同意，並經我院倫理委員會批準研究方案。

納入標準:(1)胎齡< 35周;出生體重< 2.2 kg;(3)無遺傳代謝性疾病和先天性畸形，出生後生命體征穩定。

排除標準:出生後立即喂養或嚴重疾病。

GC-MS檢測血清

喂食前分別采集血清3 ml。樣品取出並解凍。每個樣品80 μL轉入1.5 ml EP管中，與10 μL內標(l -2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/ml)混合10 s。然後加入240 μL甲醇:乙腈(2:1)，用渦流混合器混合1 min，冰水浴超聲5 min， - 20℃靜置10 min。離心10 min (12000 rpm, 4℃)，上清150 μL裝入衍生玻璃瓶。以等體積混合所有樣品提取物製備質量控製樣品。在玻璃衍生物瓶中加入80 μL鹽酸甲氧胺吡啶溶液，震蕩2min後在激波培養箱中進行肟化反應，再加入80 μL BSTFA衍生物試劑和20 μL己烷。湍流2 min後，樣品置於70°C 60 min，進行GC-MS代謝組學分析[6］．

采用美國Agilent Co. 7890B-5977A GC/MSD GC- ms采集數據，GC- ms色譜條件為DB-5MS毛細管柱，高純氦氣載氣，流速為1 ml/min，進樣口260℃，進樣量1 μL。溫度編程包括以8°C/min加熱到125°C，以5°C/min加熱到210°C，以10°C/min加熱到270°C，以20°C/min加熱到305°C，然後在305°C保持5分鍾。質譜條件為電子轟擊離子源(EI)，離子源230°C，四巴150°C，電子能量70 eV。掃描模式為全掃描模式(scan)，質量掃描範圍為m/z 50-500。每15個分析樣品中插入一個QC樣品，以檢查整個分析過程的可重複性。

數據分析

將GC/MS原始數據轉換到ChemStation (E.02.02.1431)分析軟件，轉換為CDF格式後，利用chromof 4.34軟件對數據進行預處理，提取峰、消噪、反褶積，利用Fiehn數據庫對代謝物進行鑒定和峰對齊，推導出CSV格式的三維數據矩陣[7］．

數據質量控製采用內部標準。去除原始數據矩陣的內部標準峰和已知的假陽性峰，將缺失值替換為0。在每個樣本中，所有峰值信號強度都被歸一化。然後將數據乘以10000，去除冗餘，合並峰值，得到數據矩陣。檢測到的物質數量為397種。

數據矩陣的值經過log2轉換後轉換為SIMCA14.0，采用無監督主成分分析(PCA)觀察樣本的整體分布和整個分析過程的穩定性。如果R²X值大於0.5，然後采用有監督正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)來區分組間代謝譜的整體差異。為防止模型過度擬合，采用7倍交叉驗證和200響應置換檢驗(RPT)對模型質量進行了考察。

采用多維分析和一維分析相結合的方法篩選組間差異代謝物。篩選標準為OPLS-DA模型第一主成分投影(VIP) > 1的重要變量，以及p- Student的t檢驗值< 0.5。然後計算兩組差異代謝物的fold change (FC)。

通過MBROLE通路分析，分析差異代謝物，基於KEGG數據庫(https://www.genome.jp/kegg/pathway.htm)，以豐富相關代謝途徑。

從臨床檢驗結果中，我們選擇了一些可能與差異代謝物密切相關的指標，並使用SPSS 21.0軟件中的Pearson相關係數來識別對NEC有較高診斷價值的指標。繪製受試者工作特征(ROC)曲線，計算ROC曲線下麵積(AUC)，分析顯著差異代謝產物對早產相關疾病的診斷價值。

足月和早產兒喂養前血清代謝譜分析

兩組PCA、PLS-DA、OPLS-DA評分及排列分析結果見圖。1，2而且3.， OPLS-DA模型200次響應排列檢驗結果如圖所示。4．

OPLS-DA模型顯示，喂養前早產兒的代謝特征與足月嬰兒組明顯分離。R²X R²Y和Q²模型值分別為0.602、0.980和0.877。經過200次更換試驗，R²和問²截距分別為0.725和−0.304，表明OPLS-DA模型未過擬合，兩組在OPLS-DA評分圖(譜分離)上存在顯著差異。

足月和早產兒喂養前血清代謝產物及代謝途徑分析

在多維模型中，發現VIP > 2的9種代謝產物:木糖、月桂酸、木木素、沒食子酸、o -琥珀酰- l-高絲氨酸、d -果糖1,6 -二磷酸、胱氨酸、果糖-6-磷酸、o -磷蘇氨酸。在一維模型中，發現的9種代謝物最小P值(P< 0.01)為木糖、o -琥珀酰- l-高絲氨酸、4-雄烯-11β-ol-3,17-二酮、分析物431、沒食子酸、o -磷蘇氨酸、單硬脂酸、檸檬酸和d -果糖1,6-二磷酸。篩選結果見表1．

取橫坐標的代謝途徑名稱，-log (p-value)為縱坐標，我們繪製了喂養前早產兒/足月兒的代謝通路(圖。5)．對應的-log (p-value)大於2 (p-value < 0.01)表示通路有顯著差異。這些代謝產物提示，早產兒代謝通路紊亂包括ABC轉運蛋白、β-丙氨酸代謝、嘧啶代謝、色氨酸代謝、脂肪酸生物合成、泛酸和CoA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氨基酰基- trna生物合成。

差異代謝物與臨床相關指標的相關性分析

差異代謝物與臨床相關指標的Pearson相關係數見表2．白蛋白與o -琥珀酰- l-高絲氨酸、檸檬酸、胱氨酸、總膽紅素和木糖、4-雄甾酮-11β- 3,17-二酮、分析物431、沒食子酸、單硬脂酸和月桂酸之間存在中度相關性(0.8 > r > 0.5)。

差異代謝產物對早產相關疾病的診斷價值分析

表中為差異代謝物的ROC曲線及對應的AUC3.結果顯示，o -磷蘇氨酸、木犀草素、沒食子酸、單硬脂酸、檸檬酸和d -果糖1,6-二磷酸對AUC為> 0.9的早產兒具有較高的診斷價值。

早產兒出生後要迅速適應外部環境。早產兒由於係統不發達，脂質代謝狀態不成熟，體內糖原和脂肪儲備不足，容易受到內外環境的影響，導致體內內分泌激素發生變化。同時，一些酶的活性一直很低或完全缺乏，這也影響了相應氨基酸的代謝[8，9，10］．然而，早產兒代謝特征的研究仍需進一步研究。如果我們能夠全麵識別早產兒的代謝特征，將會增進我們對與早產密切相關疾病的代謝特征的認識。代謝組學是研究細胞在一定時間內的所有代謝物，代謝物代表環境條件[11］．在本研究中，我們選擇早產兒血清作為測試對象，主要是因為血清代謝的變化可以反映疾病或病理的代謝特征。

在本研究中，我們發現特異性代謝產物發生了明顯變化，其中木犀草素增加，木糖、o -琥珀酰- l-高絲氨酸和月桂酸減少。在臨床隨訪中，5例診斷為NEC(早產兒4例，足月兒1例)。對這些病例的血清代謝產物進行分析，以便進一步討論。研究發現，葡萄糖酸、月桂酸和棕櫚酸含量的差異與De Magistris的研究一致[12]和威爾科克[13]，這為NEC代謝組學提供了可能的研究方向。由於病例較少，我們將本研究中早產兒血清代謝特征進行了整體的相關性分析，而未對NEC嬰兒進行單獨的相關性分析。我們將繼續收集臨床資料，研究代謝物相關疾病的發病機製。

代謝途徑富集圖能充分反映某一時間早產兒血清代謝物的特征。在本研究中，變化最顯著的代謝途徑包括ABC轉運體、β-丙氨酸代謝、嘧啶代謝、色氨酸代謝、脂肪酸生物合成、泛酸鹽和CoA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氨基酰基- trna生物合成。以期為早產相關疾病的早期預測提供一種新的方法[14]，特別是NEC的早期預測，通過探索多種代謝物之間的聯係，以及蛋白質、細胞因子和其他代謝物之間的聯係，通過多維模型。我們甚至可以通過幹擾某些代謝途徑來預防NEC的發生。目前，一些人正在努力開發動物模型[15］．

差異代謝物與臨床檢驗指標的Pearson相關分析表明，代謝物的變化與臨床指標的變化有關。ROC和AUC分析顯示，某些代謝產物，包括o -磷蘇氨酸、木木素、沒食子酸、單硬脂酸、檸檬酸和d -果糖1,6-二磷酸，對早產相關疾病和NEC具有一定的診斷潛力。斯圖爾特(16]及Dessì [17]，他們在之前的研究中提出不能使用單一的代謝物來診斷NEC，這表明NEC可能需要多種代謝物來診斷NEC。c反應蛋白(CRP)和降鈣素(PCT)已被用作預測NEC的可能標記物[18］．但是，我們發現炎症標誌物與差異代謝物之間的相關性並不顯著，這可能會排除這些指標作為候選標誌物，至少，它們之間的關係還有待進一步確認。

本研究對早產兒代謝物的GC-MS篩選，在一定程度上提示了早產兒代謝物在NEC診斷中的潛力，為NEC早期診斷標誌物的探索提供了方向。由於我們的研究隻篩選了代謝物，NEC預測的可靠敏感性和特異性還需要進一步研究。

AUC:

接收機工作特性下的麵積

c反應蛋白:

c反應蛋白

艦隊指揮官:

褶皺變化

氣相:

氣相色譜-質譜聯用

NEC公司:

壞死性小腸結腸炎

OPLS-DA:

正交偏最小二乘分析

主成分分析:

主成分分析

中華民國:

接收機工作特性

RPT:

反應置換試驗

貴賓:

投影中重要的變量

本研究得到汕頭大學醫學院附屬第一醫院和汕頭大學醫學院附屬第二醫院的支持。所有這些工作都是公認的。

資金

廣東省醫學科研基金資助項目(No.;A2017385);汕頭市科技計劃([2017]182號)。

數據和材料的可用性

都包括在內。

作者及隸屬關係

1. 汕頭大學醫學院附屬第二醫院兒科外科，廣東汕頭515041

   王福生，王廣歡，於夢璐，鍾軍，徐晨斌，李丹利

2. 汕頭大學醫學院附屬第二醫院新生兒科，廣東汕頭515041

   Weizhong李

3. 汕頭大學醫學院附屬第一醫院生殖醫學中心，廣東汕頭515041

   Yongcui周

貢獻

YZ設計概念化並對手稿進行批判性審查;FS分析數據，修改稿件;WL和DL收集數據;GW協調數據收集;JZ和CX起草初稿;我翻譯了手稿。所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。

相應的作者

對應到Yongcui周．

倫理批準並同意參與

這項研究得到了倫理委員會的批準。獲得知情同意。

發表同意書

這篇綜述的發表得到了意大利佩魯賈Ospedale Santa Maria della Misericordia倫理委員會的批準。研究中提到的每位患者的父母或法定監護人均簽署了書麵知情同意書，年齡為> - 8歲的兒童簽字確認同意。

相互競爭的利益

作者宣稱他們之間沒有利益衝突。

出版商的注意

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