miR-29c/B7-H3/Th17軸在兒童肺炎支原體肺炎

背景

肺炎支原體（m .肺炎)是兒童社區獲得性肺炎最常見的原因之一。最近的研究表明，嚴重或致命的發病率m .肺炎逐漸增加，可能與炎症過度有關。然而，過度炎症的確切發病機製尚不清楚肺炎支原體肺炎(MPP)仍不清楚。本研究旨在揭示miR-29c/B7-H3/Th17軸在MPP兒童中的作用。

方法

納入2014年1月- 2015年12月呼吸科住院患兒。所有入選兒童均采用real-time PCR和ELISA法確診MP感染。如果兒童同時感染了其他病原體，就會被排除在外。共有52例MPP患兒和26例對照組納入研究。real-time PCR法檢測MPP患兒單核細胞中miR-29c的表達，ELISA法檢測可溶性B7-H3 (sB7-H3)和IL-17的表達，並探討其臨床意義。通過miR-29c過表達和沉默技術以及熒光素酶報告基因檢測來確認B7-H3是否是miR-29c的直接靶點。體外用不同濃度的B7-H3融合蛋白刺激CD4+ T細胞後，檢測轉錄因子ROR-γt和細胞因子IL-17A上清的水平。

結果

52例MPP患兒的平均年齡為77±33個月，其中男性23例，占44.2%。胸腔積液19例，占36.5%。與對照組相比，MPP患兒的miR-29c水平顯著降低，而sB7-H3和IL-17水平顯著升高P< 0.05)。恢複期miR-29c水平較急性期明顯升高，恢複期sB7-H3、IL-17水平較急性期明顯降低(P < 0.05)。MPP患兒急性期sB7-H3水平與IL-17水平呈正相關(r = 0.361，P= 0.009)。MPP合並胸腔積液患兒血清sB7-H3水平明顯高於無胸腔積液患兒(9952.3±3065.3 vs. 7449.7±2231.5 pg/ml)，且與發熱天數呈正相關。miR-29c水平與m .肺炎特異性IgG, IgM水平。高濃度B7-H3(15μg/ml)可增強ROR-γt的表達，增加IL-17A的表達。基於熒光素酶報告酶試驗和免疫熒光染色的功能研究表明，B7-H3是miR-29c的直接靶點，miR-29c沉默或過表達可上調或下調B7-H3在THP-1細胞中的表達。

結論

miR-29c/B7-H3/Th17軸在過度炎症的MPP患兒中起著至關重要的作用。miR-29c和B7-H3可能是預防和治療MPP的新靶點，可能是評估預後的新的和潛在的生物標誌物。

肺炎支原體（m .肺炎)是兒童呼吸道感染最常見的原因之一，可導致上呼吸道和下呼吸道感染，特別是社區獲得性肺炎(CAP)。根據統計數據，MP導致了高達40%或以上的兒童CAP, 18%的病例需要住院治療[1］．肺炎支原體肺炎(MPP)通常是一種溫和的自限性疾病，大環內酯類抗生素治療MPP總是有效的。據報告，嚴重或致死性MPP的發生率逐漸上升[2重症MPP (SMPP)的臨床特征包括大量胸腔積液、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、肺纖維化、阻塞性細支氣管炎甚至危及生命。同時，SMPP的後遺症包括支氣管擴張、肺不張、阻塞性細支氣管炎等。

但SMPP的病因和發病機製尚不明確，有報道稱其與宿主過度免疫反應有關，主要參與淋巴細胞，如Th1和Th17引起的過度免疫反應[3.，4細胞的激活和分化與抗原呈遞細胞上表達的共刺激分子有關，包括B7家族分子。我們前期研究顯示MPP患兒的sB7-H3水平明顯高於MPP患兒，而sB7-H3水平與促炎TNF-α水平呈正相關[5］．Chapoval AI報道B7-H3可特異性增強th1型細胞因子幹擾素γ (IFN-γ)的產生[6］．綜上所述，這些研究表明共刺激分子B7-H3通過調節Th分化在MPP的發育過程中發揮了重要作用。

B7-H3的基因表達如何被調節?既往研究表明，MicroRNAs (miRNAs)可通過轉錄或轉錄後調控基因表達，並在免疫反應引起的過度炎症的發展中發揮作用[7］．最近研究發現，B7-H3在黑色素瘤細胞中表達水平較高，過表達miR-29c可降低B7-H3的表達。MiR-29c表達在黑素瘤細胞中呈負向調控B7-H3表達[8］．

因此，我們假設miR-29c/B7-H3/Th17的軸在MPP的發展中起著至關重要的作用。我們的研究旨在探討mir-29c和B7-H3在MPP兒童中的作用和臨床意義，以及mir-29c和B7-H3在Th17分化中的作用機製，為MPP的防治提供新的線索。

研究對象

選取2014年1月至2015年12月在蘇州大學兒童醫院呼吸科住院的患兒。根據以下標準將患兒定義為MPP: 1)采用實時聚合酶鏈式反應(PCR)檢測鼻咽吸出物中肺炎分枝杆菌DNA，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測配對血清中肺炎分枝杆菌特異性IgM和IgG抗體。2)合並感染其他病原體的患者被排除。最終納入52例MPP患兒。男女比例為0.79:1。MPP患者的平均年齡為77±33個月。收集所有患者的人口學和臨床信息，包括年齡、性別、病程、發熱時間、住院時間、並發症和用藥。影像學檢查采用胸部x線攝影、胸部CT和胸部超聲。實驗室標本包括外周血和鼻咽吸出物。實驗室檢查包括血常規、c -反應蛋白(CRP)、生化功能、體液免疫和淋巴細胞亞群。 A total of 26 controls with age matched were selected from children with elective surgery including inguinal hernia, multiple fingers deformity, and fracture fixation after internal fixation from surgery wards of Children’s Hospital of Soochow University. All the controls enrolled in this study without history of infections, drugs allergy, family or personal allergy within 4 weeks. There was no significant difference in the age of children between MPP group and control group. This study was approved by the Institutional Human Ethical Committee of Children’s Hospital of Soochow University. A written consent was obtained from all the guardians who participated in this study.

外周血和鼻咽分泌物樣本

所有這些兒童在入院24小時內采集靜脈血樣本，並立即送往實驗室。標本在3000 r/min離心5 min，收集上培養液，用EP管分離。出院前采集第二組外周血標本。所有標本保存在- 70°C進行後續測定。患兒鼻咽吸入標本均在入院後24 h內采集。

定量ELISA特異性肺炎分枝杆菌IgG和IgM

特異性IgM和IgG抗體m .肺炎在急性期的患者血清樣本中檢測到m .肺炎根據製造商說明，分別使用商用ELISA試劑盒(Serion ELISA經典MP IgG/IgM, Institute Virion/Serion, Würzburg, Germany)檢測肺炎(入院時)和恢複期(出院時)。檢測截止值為0.5 ×試劑盒對照血清的平均光密度(OD)，見附表。陽性IgG反應為> 24 RU/mL。IgG滴度的顯著上升被認為是OD值在截止值以上的兩倍，或者是一種血清轉換，其中第一血清為抗體陰性，第二血清的OD值至少是截止值的兩倍，對應於RU/mL滴度的三倍上升。IgM抗體陽性反應定義為> 1.1 S/CO。

肺炎支原體實時PCR檢測方法

入院24小時內進行鼻咽抽吸。搖勻，離心，取上清液，加入裂解緩衝液，−80℃保存。定量診斷試劑盒(大安基因股份有限公司)中國廣州)m .肺炎DNA被用來測量m .肺炎．該方法基於TaqMan PCR技術，靶點為16S rRNA基因特異性m .肺炎基因組。簡單地說，1 mL經4% NaOH稀釋的鼻咽吸出物以12,000轉/分離心5分鍾。收集沉澱物，0.9% NaCl洗滌2次，加入50 μL DNA提取液，100℃孵育10 min, 12000 rpm離心5 min。采用DA 7600 Real-time PCR係統(Applied Biosystems, CA, USA)對2 μL和43 μL PCR混合液(隨試劑盒提供)的上清液進行實時PCR，方法如下:93°C 2 min, 93°C 45 s, 55°C 60 s, 10個循環，93°C 30 s, 55°C 45 s。

多種病原體檢測

采用直接免疫熒光法檢測呼吸道常見病毒7種，包括呼吸道合胞病毒、A型和B型腺病毒流感病毒、1-3型副流感病毒。檢測試劑盒購自美國chemion公司。所有程序都按照製造商的要求進行^，年代指令。采用RT-PCR方法檢測人偏肺病毒，采用上文所述的熒光定量PCR方法檢測人波卡病毒[9，26］．

血漿可溶性B7-H3和IL-17的檢測

ELISA法檢測外周血可溶性B7-H3和IL-17水平。該程序是根據製造商的說明。可溶性B7-H3試劑盒購自旭光科技有限公司。蘇州。IL-17 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。

外周血單透明細胞中miR-29c的測定

收集分離的外周血單個核細胞，使用Ambion公司的mirVanaTM miRNA分離試劑盒進行細胞裂解、有機提取、miRNA富集，提取總miRNA。按生產廠家的說明操作。簡單地說，根據製造商的協議，使用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems)進行10 ng總RNA的逆轉錄聚合酶鏈反應。熱循環條件為:16℃30 min, 42℃30 min, 85℃5 min, 4℃5 min。在Bio-Rad iQ5實時PCR係統中使用TaqMan通用PCR Master Mix Kit(Applied Biosystems)進行qRT-PCR，並使用U6作為內源性對照。根據製造商的協議，進行了三次反應。熱循環條件為:50°C 2分鍾，95°C 10分鍾，95°C 40次循環15秒，然後60°C 1分鍾。qRT-PCR實驗完成後，測定三次重複反應的循環閾值(Ct)平均值。數據分析采用2^——ΔΔCt方法。

B7-H3調節CD4+ T細胞中ROR-γt的表達和IL-17A的分泌

CD4⁺T細胞(1 × 10⁵細胞/ml)從健康人外周血中分離n= 3，中國蘇州紅十字會捐贈)使用帶有CD4的autoMACS柱⁺T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec)。37℃，5% CO培養24小時後₂收集增殖的T細胞，並將其播種到6孔平板上，平板上預塗抗cd3單抗(50ng /ml)和抗cd28單抗(500ng /L)，購買自中國蘇州光明科星生物技術公司。然後分別向孔中加入不同劑量的B7-H3 (0 μg/ml、0.6 μg/ml、3 μg/ml和15 μg/ml)。另取24 h後，取無細胞上清測定IL-17細胞因子，取細胞測定ROR-γt mRNA的相對表達量。

轉染miR-29c和免疫熒光染色檢測B7-H3

THP-1細胞(ATCC, Manassas, VA, USA)按1 × 10接種⁵細胞/60 mm培養皿，然後使用Jetprime™轉染試劑(VWR International, Radnor, PA)轉染100 nM plentia - mir -29c、anti-miR-29c或空載體。轉染24小時後，用1 mg/ml Pronase E (E. Merck, Darmstadt, Germany)在37℃下處理細胞30分鍾，剝離細胞表麵已經存在的B7-H3蛋白，再過48小時後，用抗B7-H3單抗(8H9)免疫熒光染色檢測新表達的B7-H3蛋白水平。使用數字切片掃描儀成像，使用Image-Pro Plus軟件獲取切片灰度。

3 ' -UTR報告結構和熒光素酶測定

B7-H3 3 ' - ultra - wt和突變體購自NOVOBIO(中國上海)。合成B7-H3 3'UTR或單堿基突變體中miR-29c結合位點對應的寡核苷酸，並插入pgl3控製載體(novbio Co.， Shanghai, China)螢火蟲熒光素酶終止密碼子的下遊XbaI位點。人單核細胞細胞係THP-1來自美國類型培養集合(ATCC, Manassas, VA, USA)。根據製造商的協議，使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)在24孔板中共轉染THP-1細胞，其中50 ng的螢火蟲熒光素酶報告蛋白，1 ng的腎螢光素酶報告蛋白(Promega)作為轉染對照，100 nM的plentil - mir -29c (novbio Co.， Shanghai, China)。轉染24小時後，用雙熒光素酶測定法(Promega)連續測定螢火蟲和腎蟲的熒光素酶活性，並用BioTek™Microplate Reader進行評估。

數據分析

測量數據的正態分布表示為(\(\overline{x} \)±SD)，兩組比較采用學生t檢驗。計量資料的非正態分布以中位數(四分位間距)表示，兩組間比較采用Wilcoxon檢驗。計數數據采用卡方檢驗或Fisher確切檢驗。采用SPSS 18.0軟件包進行統計學分析。一個雙邊p-value < 0.05為有統計學意義。

MPP兒童的人口學數據、臨床和實驗室特征

本研究共納入52例MPP患兒。MPP兒童的人口學數據、臨床和實驗室特征見表1．患兒平均年齡77±33個月，其中男性23例，占44.2%，有胸腔積液19例，占36.5%。

miR-29c, sB7-H3和IL-17在MPP患兒中的表達

如圖所示。1與對照組相比，MPP患兒的miR-29c水平顯著降低，而sB7-H3和IL-17水平顯著升高P< 0.05)。22例MPP患兒在恢複期(至少晚1周)取外周血，檢測miR-29c、sB7-H3、IL-17水平。結果顯示，恢複期miR-29c較急性期明顯升高，恢複期sB7-H3和IL-17明顯降低。sB7-H3水平與IL-17呈正相關(r = 0.361，P= 0.009)。

MPP中miR-29c、sB7-H3和IL-17在有無胸腔積液的比較

胸腔積液是嚴重炎症反應的一種指標和臨床表現。因此，在MPP合並胸腔積液病例中探討上述炎症因素。如圖所示。2MPP合並胸腔積液患兒血清sB7-H3水平明顯高於無胸腔積液患兒(9952.3±3065.3 vs 7449.7±2231.5,pg/ml);P= 0.0015)。兩組間miR-29c和IL-17水平無明顯差異。

MPP患兒中miR-29c、sB7-H3、IL-17水平與臨床參數的相關性

如表所示2， sB7-H3水平與發熱時間呈正相關(P< 0.05)， miR-29c水平與m .肺炎特異性IgG和IgM水平均高於對照組(P<0.05)。sB7-H3、miR-29c與其他臨床參數無顯著差異。

B7-H3對CD4的作用⁺T細胞中ROR-γt和IL-17A的表達

將不同濃度的B7-H3融合蛋白(0.6 μg / ml、3 μg / ml和15 μg / ml)或人IgG作為對照組與CD4共培養⁺T細胞在24小時後用磁珠分離。real-time PCR檢測轉錄因子ROR-γt的表達，ELISA檢測上清中IL-17A的濃度。如圖所示。3.高濃度B7-H3 (15μg/ml)可提高ROR-γt的表達，增加上清中IL-17A的表達。

B7-H3是miR-29c通過熒光素酶報告實驗證實的靶點

為了檢驗miR-29c是否真的能與B7-H3 3 ' -UTR結合，我們使用熒光素酶技術將熒光素酶報告蛋白構建(LightSwitch 3 ' -UTR報告蛋白GoClone)與B7-H3 3 ' -UTR序列結合。報告蛋白與miR-29c共轉染THP-1細胞，24小時後測定熒光素酶活性。與轉染陰性對照miRNA或含有B7-H3 3 ' -UTR突變體的結構相比，轉染miR-29c顯著抑製了含有B7-H3 3 ' -UTR結構的熒光素酶活性，表明miR-29c直接與B7-H3 3 ' -UTR結合，如圖所示。4．同時，通過免疫熒光分析，過表達或沉默miR-29c可下調或上調THP-1細胞中B7-H3的表達(圖1)。5）.

MPP是兒童的常見病和多發病。MP是蘇州地區住院兒童CAP最常見的病原。事實上，MP感染在嬰兒中甚至很常見[9，10，11］．近年來，SMPP發病率呈上升趨勢，給世界各國特別是亞洲國家帶來了沉重的醫療負擔[11，12，13，14］．據我們所知，過量的宿主免疫反應可能在SMPP的發生過程中起一定作用[14，15］．本研究旨在闡明MPP中適應性免疫反應的可能機製。在本研究中，我們證實了共刺激分子B7-H3通過促進Th17的極化在MPP的免疫-炎症反應中發揮重要作用。MPP患兒上清液中sB7-H3和IL-17水平升高，miR-29c表達降低，且sB7-H3和IL-17表達呈正相關。

據報道，與健康組相比，SMPP患者檢測到更高的Th17細胞頻率和更高的IL-17水平，但與treg的頻率和TGF-β1水平無顯著差異。提示Th17細胞在SMPP中起重要作用[15，16］．MP抗原或裂解產物均可誘導小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-17A的高表達[16，17]，可刺激小鼠淋巴細胞增殖，然後由Th17細胞分泌IL-17A [4］．綜上所述，這些研究表明Th17細胞和IL-17在MPP中發揮了重要作用，但具體機製尚不清楚。多項研究表明，MP可刺激肺泡巨噬細胞產生IL-23，然後IL-23誘導激活CD4細胞產生IL-17⁺T細胞。相比之下，單獨阻斷IL-23可導致小鼠BALF中mp誘導的IL-17顯著減少[17，18］．而Th17細胞分化則由IL-23參與[18，19]，表明MP誘導的Th17細胞分化被IL-23參與。

現在已經知道Th的激活和分化需要雙重信號刺激。共刺激分子是一組異質細胞表麵分子，其作用是放大或抵消T細胞受體(TCR)與抗原/主要組織相容性複合體(MHC)相互作用後提供給T細胞的初始激活信號，從而影響T細胞分化[19，20.］．其激活和分化與抗原提呈細胞上表達的共刺激分子有關，包括B7家族分子。最近，Luo等人利用B7-H3缺陷小鼠(B7-H3 KO)評估了B7-H3在實驗性自身免疫性腦脊髓炎、實驗性哮喘和膠原性關節炎中調節Th1、Th2和Th17亞群的功能，認為B7-H3對Th1/Th17有作用，並可增強IFN-γ和IL-17的產生[20.，21］．這與我們的研究結果一致，B7-H3通過調節Th17分化和促進IL-17分泌在MPP兒童免疫發病機製中發揮作用。在本研究中，我們還證實了兒童MPP中sB7-H3和IL-17水平呈正相關。

B7-H3的基因表達受包括miRNAs在內的多種因素控製。此前的一項研究表明，MicroRNA-187在透明細胞腎細胞癌中表達下調，與生存率降低相關，可通過靶向B7-H3抑製細胞生長和遷移[21，22］．乳腺癌患者中靶向調控B7-H3的miRNAs有13種，其中隻有miR-29c與乳腺癌患者預後相關[22，23］．我們的研究目的是確定兒童MPP中sB7-H3和IL-17的表達水平。通過熒光素酶報告子實驗確認B7-H3是miR-29c的直接靶點。體外證實了miR-29c/B7-H3/Th17軸的逐漸調節，miR-29c、sB7-H3、IL-17在急性期和恢複期的表達與體外結果一致。sB7-H3與乳酸脫氫酶(LDH)的相關性無統計學意義，但有相關趨勢。LDH已被證實與MPP的嚴重程度相關，LDH是MPP類固醇治療的指示標誌物[23，24］．然而，在MPP兒童中miR-29c和sB7-H3之間沒有關聯，這可能是因為除了miR-29c外，還有其他miRNAs調節B7-H3的表達[21，22，23，24，25，26］．有趣的是，血清中miR-29c的表達水平與m .肺炎這提示miR-29c低表達的兒童可能對MP感染有過度的炎症免疫反應。但其機理還有待進一步探索。

我們的研究表明，miR-29c/B7-H3/Th17軸在過度炎症的MPP兒童中起著至關重要的作用。miR-29c和B7-H3可能是預防和治療MPP的新靶點，可能是評估預後的新的和潛在的生物標誌物。

ARDS:

急性呼吸窘迫綜合征

B7-H3:

共刺激分子B7-H3

BALF:

支氣管肺泡灌洗液

帽子:

社區獲得性肺炎

ELISA:

酶聯免疫吸附測定法

M.Pneumoniae:

肺炎支原體

miR-29c:

MircoRNA-29c

MPP:

肺炎支原體肺炎

聚合酶鏈反應:

實時聚合酶鏈反應

SMPP:

嚴重的米ycoplasma肺炎肺炎

不適用。

資金

國家自然科學基金項目[陳正榮，資助號:81771676 81401296;紀偉，資助號81570016;江蘇省醫學青年人才[陳崢嶸，資助號QNRC2016766];江蘇省中醫局科技項目[陳崢嶸，資助號YB2015176];蘇州市社會發展項目[陳崢嶸，資助號SS201869;閆永東，資助號，SS201537]，蘇州市衛生局科技計劃項目[閆永東，資助號LCZX201409]，江蘇省社會發展計劃項目[郝創立，BE2016676]，蘇州市呼吸疾病重點實驗室[郝創立，SZS201714]。

數據和材料的可用性

在本研究過程中產生或分析的所有數據均可根據合理要求從通訊作者處獲得。

作者指出

1. 李慶玲和吳銀銀對這項工作貢獻相同。

作者和隸屬關係

1. 215003江蘇省蘇州市景德路303號蘇州大學兒童醫院呼吸內科

   李慶玲，吳銀銀，孫慧明，顧文靜，張新星，王美娟，閆永東，郝闖利，紀偉，陳正榮

貢獻

QL、YW撰寫主要稿件文本;CH、YY、WJ收集並分析臨床資料;H. S.完成了細胞和分子生物學等實驗;ZC負責研究設計。所有作者都審閱了手稿。所有作者閱讀並批準了最終稿件。

相應的作者

對應到Zheng-rong陳．

倫理批準和同意參與

本研究獲蘇州大學兒童醫院機構人類倫理委員會批準。所有參與本研究的監護人均獲得書麵同意。

發表同意書

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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