先天性腎病綜合征伴22q11.2重複綜合征1個中國家庭及內含子NPHS1 c. 3286 + 5G > a突變功能分析

背景

先天性腎病綜合征(先天性腎病綜合征，CNS)的定義為重蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和水腫，多由腎髒腎小球濾過屏障結構蛋白的單基因缺陷引起。22q11.2重複綜合征是一種具有多種臨床特征的染色體疾病，從正常到智力遲鈍和先天性缺陷不等。在一個病人身上同時發生兩種遺傳疾病是罕見的。

案例展示

先證者於36周齡自然出生，出生時體重2350克。出生後6天，先證者因發熱38.5°C，持續6小時入院。入院時體格檢查表現為遠視過度、眼瞼水腫、鼻梁寬、鼻上翹、耳廓畸形、中耳部長、上唇薄等畸形特征。此外，我們發現該患者左手腕下垂，雙側肌腱外翻，雙側膝關節屈曲攣縮。檢測到的一係列指標顯示異常。用白蛋白緩解低蛋白血症和水腫。然而，父母拒絕接受進一步的治療，男孩在3個月大時死於惡病質。為確定發病機製，進行了遺傳分析，發現NPHS1基因有兩個突變:Exon18: C . 2386g > C;p. (Gly796Arg)遺傳自母體，內含子24:c.3286 + 5G > A;p。? inherited from father. And he also had a 22q11.2 duplication which was inherited from his mild affected mother. The pathogenesis of the intronic mutation has been further identified that it can defect alternative splicing of NPHS1.

結論

我們報告了一位同時患有先天性腎病綜合征和22q11.2重複綜合征的患者，強調了新的測序技術在不同遺傳疾病診斷中的重要性。

腎病綜合征(NS)是一種罕見的疾病，臨床表現為水腫，生化表現為大量蛋白尿(> 40 mg/m2/h，或> 50 mg/kg/d)、低蛋白血症(< 25 g/l)和高脂血症。先天性腎病綜合征(CNS)通常出現在出生後的前0-3個月，可能由先天性梅毒、弓形蟲病或先天性病毒感染(如巨細胞病毒)引起。然而，大多數中樞神經係統病例是由形成腎小球濾過屏障的結構蛋白的單基因缺陷引起的。包括NPHS1、NPHS2、WT1、PLCE1和LAMB2等多個基因的突變[1) . .在涉及的基因中，編碼nephrin的NPHS1基因突變是CNS的主要原因，主要影響外顯子，也影響剪接位點[2］．根據以前報道的病例，先天性腎病綜合征沒有畸形特征。

22q12 .2重複綜合征是一種染色體疾病，是一種較新的綜合征，其臨床特征多種多樣，包括正常、智力遲鈍和先天缺陷[3.，4］．根據已發表的報告，大多數22q11.2重複的患者從輕微或不受影響的父母那裏繼承了這些基因，而不是來自新的突變，而且也沒有報告顯示22q11.2重複綜合征伴有水腫、蛋白尿、低白蛋白血症或高血脂[3.，5，6］．

得益於基因檢測技術的快速發展，在一個患者身上同時發生兩種罕見遺傳疾病的報道非常罕見[7，8，9，10]，在這裏，我們報告一個患者被捕捉到CNS和22q11.2重複綜合征。此外，我們通過小基因試驗分析內含子突變c. 3286 + 5G > A對NPHS1轉錄本剪接的影響，發現該突變導致了在小基因剪接試驗中外顯子24跳過的異常剪接。在此基礎上，我們驗證了NPHS1中c.3286 + 5G > A內含子突變的發病機製。總之，本報告將為監測和強調在單個患者中同時發生多種遺傳疾病的可能性提供啟示。

案例展示

先證者於36周齡自然出生，出生時體重2350克。他是20歲的G2P2無血緣關係的母親和26歲的父親的第二個孩子。有一個哥哥，當時16個月大，按照父親的說法，他發育得很好。母親患有中度學習障礙，有自理日常生活的能力，但在學校表現較差，尤其是數學。母親在懷孕期間沒有接受定期的產前檢查。出生後6天，先證者因發熱38.5°C，持續6小時入院。

入院時體格檢查表現為遠視過度、眼瞼水腫、鼻梁寬、鼻上翹、耳廓畸形、中耳部長、上唇薄等畸形特征。此外，我們發現該患者左手腕下垂，雙側肌腱外翻，雙側膝關節屈曲攣縮。1)．

先證者的變形特征。遠視過度，眼瞼水腫，寬鼻梁，上翹鼻，耳廓畸形，中耳部長，上唇薄。另外，左手腕下垂及雙側肌腱外翻，雙側膝關節屈曲攣縮

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實驗室檢查:低蛋白血症(總蛋白28.4 g/L (65 ~ 85 g/L)，白蛋白13.5 g/L (35 ~ 55 g/L)，球蛋白14.9 g/L (20 ~ 40 g/L)，高脂血症(甘油三酯2.26 mmol/L (0.3 ~ 1.92 mmol/L)，膽固醇7.69 mmol/L (2.32 ~ 5.62 mmol/L)，低密度脂蛋白膽固醇5.82 mmol/L (1.9 ~ 3.12 mmol/L)，重度蛋白尿(每周3次尿蛋白4+)。進一步實驗室檢查HBsAg、HCV Ab、HIV Ab、TPPA、TORCH Ab陰性，泌尿係統超聲檢查未見異常。用白蛋白緩解低蛋白血症和水腫。最後，父母拒絕接受進一步的治療，男孩在3個月大時死於惡病質。

方法

使用TruSight One測序麵板(Illumina, USA)對患者進行靶向下一代測序(NGS)，其中包括136個與泌尿係統遺傳病相關的候選基因。然後使用局部算法(中國金虞醫學遺傳實驗室)來探索在麵板覆蓋的區域內是否存在拷貝數變化。NGS發現了NPHS1基因的兩個突變。其中exon18: C . 2386g > C;p. (Gly796Arg)遺傳自其母親，內含子24:c.3286 + 5G > A;p。?繼承了他父親的遺產。NGS還提示22q11.21染色體上有1.8 Mb可疑的重複，這可能是患者畸形特征的原因。用CytoScan750Karray (Affymetrix, USA)進行染色體微陣列分析(CMA)進一步確定染色體畸變，發現22q11.21染色體上有3.2 Mb的重複，該重複來自其母親在同一區域的2.8 Mb重複。為了明確內含子突變c. 3286 + 5G > A是否具有致病性，我們進行了小基因分析以確定內含子變異的發病機製。 We amplified a 1029-bp genomic DNA fragments by PCR, including exon 24, intron 24 and exon 25 of NPHS1 from the proband carrying the c. 3286 + 5G > A variant and a healthy control carrying the wild-type c. 3286 + 5G. The PCR products were ligated to exon trap vector pSPL3 (friendly provided by Prof. Jörg Gromoll). Aberrantly spliced transcripts were identified by sequencing their RT-PCR products with primer SD6 (F) and SA2 (R) (Table1)，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離得到。

在這份報告中，我們描述了一個新生兒，誰被轉診到我們的醫院發燒。第一眼，我們注意到這個男孩的眼瞼水腫和麵部和四肢畸形特征(圖。1)．實驗室檢查證實為中樞神經係統。然而，畸形特征不能用中樞神經係統來解釋。因此，利用含有136個泌尿係統遺傳病和CMA相關候選基因的NGS麵板檢測該男孩及其父母的遺傳異常。NGS顯示NPHS1基因的突變分別來自其父母(圖1)。2)，以及22q11.21染色體上可疑的1.8 Mb重複。CMA證實22q11.21染色體上有3.2 Mb的重複，這是遺傳自他母親在同一區域的2.8 Mb的重複(圖1)。3.)．

桑格序列驗證NPHS1NGS發現的突變

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先證者用CytoScan 750 K陣列(Affymetrix, USA)的CMA結果顯示22q11.21染色體上有3.2個重複

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NPHS1基因突變導致芬蘭型中樞神經係統，這是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，在生命的頭3個月出現，甚至可能在子宮內開始[11］．CNS患兒多為早產兒，胎齡出生體重較低。中樞神經係統的病程是進行性的，常在2或3歲時導致終末期腎病[12］．在這個病人中，我們發現了NPHS1基因的兩個突變。其中exon18: C . 2386g > C;p.(Gly796Arg)遺傳自母親，內含子24:c.3286 + 5G > A;p。?繼承了他父親的遺產。錯義突變C . 2386g > C;p.(Gly796Arg)曾由Buscher等人報道過[13彌漫性係膜硬化。它還被Polyphen預測為一種致病性突變，得分為1.000，並被SIFT預測為影響蛋白質功能的得分為0.051)．內含子突變c.3286 + 5G > A;p。?曾被Wand等人報道過。[14]，這是預測最可能影響拚接通過Human splicing Finder和MaxEntScan::scoresplice。然而，從來沒有功能實驗來驗證這個內含子突變的致病性。為了進一步確定內含子突變c.3286 + 5G > A的致病性，我們進行了小基因分析，發現c.3286 + 5G > A突變導致24號外顯子跳過的異常剪接(圖1)。4)．根據出生後幾天內出現的水腫和與遺傳結果相關的典型生化結果，以及nphs1突變的功能分析，不難診斷為中樞神經係統疾病。

一個pSPL3小基因構建中c.3286 + 5G > A的RT-PCR產物。巷道1:1000bp標記。2、3道:拚接異常帶。4、5道:正常頻段。道6和道7:空向量。8道:空白控製。b用於體外剪接試驗的微型基因載體的剪接示意圖。野生型轉錄本有三個不同的波段，波段1(407-bp)，波段2(288-bp)和波段3(263-bp)。帶1是外顯子24和外顯子25的產物。2帶有25號外顯子。3波段沒有外顯子，隻有pSPL3載體的序列。突變型中1帶缺失，突變c.3286 + 5G > A導致24外顯子跳過的異常剪接。c凝膠提取1、2、3條帶後直接測序

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然而，中樞神經係統通常具有麵部和四肢的畸形特征。因此，利用CytoScan 750 K陣列(Affymetrix, USA)的CMA進一步驗證了NGS暗示的22q11.21染色體上的可疑重複。同時用CMA檢測父母的外周血淋巴細胞。我們在22q11.21染色體上發現了一個3.2 Mb的重複，繼承自他母親在同一區域的2.8個重複。與單基因疾病不同，22q11.2重複綜合征是一種染色體疾病，是一種相對較新的綜合征，具有多種臨床特征，從正常到智力遲鈍，並伴有先天性缺陷，包括多囊性發育不良腎髒和食管閉鎖/氣管-食管瘺和血管增生[3.，4，15，16］．然而，該患者的關節攣縮從未在該綜合征中報道過。由於缺乏產前資料，很難斷定這是22q11.2重複綜合征的新表現或羊水過少的後果。22q11.2重複綜合征的臨床表現具有很大的異質性。然而，根據以往報道的病例，到目前為止沒有與該綜合征相關的生化異常，如低蛋白血症或高膽固醇血症。

這是一個有趣的案例。在一名患者中，我們發現了兩種遺傳疾病，中樞神經係統和染色體22q11.2重複綜合征。盡管在多囊發育不良腎中有22q11.2重複的報道[16泌尿係統超聲檢查未見異常。綜上所述，我們認為先證者患有兩種不同的遺傳疾病，這兩種疾病是相互獨立的。一個病人同時患有兩種或兩種以上的遺傳疾病，這可能不是一個奇跡。隨著基因檢測技術的快速發展，新的發現將日益影響我們對人類遺傳學的傳統理解。

由於該患者早死於CNS，我們無法描述22q11.2重複綜合征更詳細的表現，如精神運動和智力發育情況。但先證者明顯的畸形特征和其母親的中度學習障礙表明該家族的這種染色體異常具有致病性。如果這個家庭計劃再生一個孩子，遺傳谘詢和產前診斷是必要的。

總之，我們報告了一位同時患有先天性腎病綜合征和22q11.2重複綜合征的患者。該患者的報告具有監測和強調在單一患者中同時發生多種遺傳疾病的可能性的意義。此外，我們還發現了一種新的NPHS1內含子突變，並從功能上定義了內含子突變對導致異常剪接很重要，這擴大了NPHS1基因突變的譜。

在當前的研究中產生和分析的數據集都顯示在手稿中。

CMA:

染色體微陣列分析

中樞神經係統:

先天性腎病綜合征

門店:

下一代測序

NS:

腎病綜合症

我們非常感謝患者及其家屬的貢獻。這份報告沒有資金來源。

本研究的任何目的均未收到任何個人或組織的資助。

作者和隸屬關係

1. 266003山東省青島市市南區江蘇路16號青島大學附屬醫院新生兒科

   李亮亮，奚宏民，馬麗麗，邵輝，江紅

2. 青島大學附屬醫院兒科中心神經內分泌科，青島，中國

   智易

3. 青島大學附屬醫院重症監護室，青島，中國

   了雯雯王

4. 北京大學第一醫院中心檢驗科，中國北京

   香港鍋

5. 青島大學附屬醫院醫學遺傳科，中國青島

   李苗苗

貢獻

HJ構思了這項研究。LL、HX和LM參與了研究設計數據的采集和分析。W.W和H.P參與了數據分析和結果檢驗。ZY, LL和HS起草了手稿。ML負責打磨和提交。所有作者都認真審閱了稿件，參與了修改並批準了最終稿件。

相應的作者

對應到香港江．

倫理批準和同意參與

獲得青島大學附屬醫院的研究批準和倫理許可。在收集數據之前，必須取得兒童監護人的書麵同意。

發表同意書

我們獲得了病人監護人的書麵同意發表。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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