miR-222-3p在肺炎支原體肺炎患兒中的高表達gydF4y2Ba

目標gydF4y2Ba

肺炎支原體是兒童社區獲得性肺炎的主要原因。但其發病機製尚不完全清楚，可能與microRNAs有關。本研究旨在探討mirna -222-3p (miR-222-3p)在兒童肺炎支原體肺炎(MPP)中的表達及其可能的作用。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

來自蘇州大學兒童醫院的36名MPP患兒和27名年齡匹配的對照者參與了這項研究。采用實時熒光定量PCR技術檢測兒童外周血血漿MiR-222-3p和分化4 (CD4)聚類mRNA。用肺炎支原體脂相關膜蛋白(lamp)刺激THP-1細胞和小鼠。gydF4y2Ba

結果gydF4y2Ba

MPP患兒外周血中miR-222-3p水平顯著升高，CD4水平顯著降低(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。此外，16例MPP合並胸腔積液患兒的miR-222-3p水平高於無胸腔積液患兒。LAMP刺激後，THP-1細胞中MiR-222-3p或CD4呈劑量依賴性升高或降低。在lamp刺激的小鼠中，大量炎症細胞浸潤在細支氣管周圍，miR-222-3p在支氣管肺泡灌洗液中增加。綜上所述，miR-222-3p在MPP患兒中高表達，尤其是伴有胸腔積液的患兒。gydF4y2Ba

結論gydF4y2Ba

小樣本研究表明，無論在體外還是體內，肺炎分枝杆菌或其lamp均可增加巨噬細胞的miR-222-3p並降低CD4。因此，miR-222-3p可能是MPP診斷和預後的生物標誌物。gydF4y2Ba

肺炎支原體是兒童和青少年社區獲得性肺炎(CAP)的重要病因，占兒童社區獲得性肺炎(CAP)的20 - 40% [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．肺炎支原體的一些致病因素，如過氧化氫、社區獲得性呼吸窘迫綜合征(CARDS)毒素、核酸酶和脂相關膜蛋白(lamp)等，已被報道與肺炎的發生有關[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．然而，這些致病因素不足以解釋的發病機製gydF4y2Bam .肺炎gydF4y2Ba兒童肺炎(MPP)。gydF4y2Ba

在後基因組時代的今天，RNAomics(包括mRNA、miRNA、piRNA、lncRNA等)已成為一個重要的研究熱點。除蛋白質編碼基因外，非編碼rna(如mirna、lncrna)在基因調控、細胞發育等生命活動中同樣重要，在多個層麵上調控基因，發揮重要的生物學功能。microRNA (miRNA)是由基因組的非編碼區域產生的內源性單鏈小分子RNA。研究發現，miRNA表達異常與疾病的發生發展密切相關，部分miRNA與腫瘤細胞增殖、耐藥及預後相關[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．下調這類miRNAs的表達可以抑製腫瘤細胞的增殖，加速細胞凋亡，為癌症治療帶來新思路。在實驗前期，我們比較了MPP組和NC組兒童外周血mirna的表達譜，發現包括miRNA-222-3p在內的26個差異表達mirna上調，其中包括miRNA-5704。7個miRNAs下調提示miRNAs參與了MPP的病理過程，參與了肺炎支原體的免疫應答。目前，很少有研究發現mir-222-3p在兒童mpp中具有高表達，因此選擇基因芯片中表達上調的mir-222-3p作為研究對象。通過Targetscan、Pictar和miRDB數據庫對miR-222-3p進行靶基因預測分析，確定CD4分子是miRNA-222-3p的潛在靶基因。gydF4y2Ba

病人的特點gydF4y2Ba

本研究選取2014年3月至2015年6月蘇州大學兒童醫院36例MPP患兒，排除免疫缺陷、早產、複發性肺炎及近期使用免疫抑製劑和免疫調節劑。男20例，女16例，平均年齡(6.74±2.82)歲。其中，兒童胸腔積液16例。同期健康兒童27例為對照組，男15例，女12例，平均年齡(7.08±2.74)歲。兩組患者在性別和年齡上無差異(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)，兩者具有可比性。的inclusion criteria of the control group were no history of immune system diseases and chronic infectious diseases and no respiratory tract infections, other acute and chronic diseases, no allergies and diseases closely related to immunity in the past two weeks. Ethical approval for the study was received from the Institutional Medical Ethics Review Board of Children’s Hospital of Soochow University, and the study was performed in accordance with the Declaration of Helsinki. The diagnosis ofm .肺炎gydF4y2Ba感染以血清學檢測為基礎，經鼻咽分泌物聚合酶鏈反應(PCR)試驗證實。根據英國胸科學會社區獲得性肺炎管理指南，根據所有患者的CAP臨床和影像學征象，對所有患者進行診斷[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．在患者入院後，他們的兒科醫生完成了一份關於患者人口統計和臨床數據的問卷調查。同時采集外周血樣本用於miR-222-3p和CD4檢測。27名年齡匹配的對照組在過去四周內沒有經曆過任何急性呼吸道感染，是從外科病房中隨機選擇的。gydF4y2Ba

采集外周血進行實驗室檢查並檢測miR-222-3p和CD4 mRNA。還收集了實驗室數據，如白細胞計數(WBC)、絕對中性粒細胞計數、c反應蛋白(CRP)、乳酸脫氫酶(LDH)和淋巴細胞亞群。gydF4y2Ba

血漿樣品及質量控製gydF4y2Ba

采集了3名健康對照組和3名MPP病例的外周血樣本，然後將其抽入含有edta的玻璃管中。樣品立即在3500×離心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置15分鍾。然後將得到的血漿樣本存儲在−80°C，直到分析。為了測定樣品中遊離血紅蛋白的水平，對1.5 μl總血漿進行分光光度法分析(NanoDrop 1000, Thermo Scientific) [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．在414 nm處，高於0.2的吸光度水平表明存在遊離血紅蛋白，因此溶血程度較高，此類樣品被排除在進一步分析之外。gydF4y2Ba

血漿中miRNA的芯片分析gydF4y2Ba

從人血漿中分離出總RNA [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．將200 μl血漿樣本轉入1.5 ml試管中，與750 μl含有RNA裂解試劑的裂解液(Trizol, Ambion, USA)混合。微陣列雜交、數據生成、歸一化由康臣生物工程有限公司完成。使用人類miRNA芯片(miRCURY™，Exiqon，丹麥)，包含3100個miRNA探針。采用分位數算法進行歸一化。MicroRNAs被認為是差異表達，如果他們產生一個gydF4y2BapgydF4y2Ba-value < 0.05，錯誤發現率≤0.05。如果MPP兒童與對照組相比差異超過兩倍，差異表達的miRNAs也被指定為上調或下調。gydF4y2Ba

實時定量PCR (qRT-PCR)檢測miR-222-3p和CD4gydF4y2Ba

使用Trizol試劑(Invitrogen)按照製造商的方案提取總RNA。接下來，根據製造商的協議，使用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(應用生物係統公司)對1 μg總RNA進行逆轉錄PCR。熱循環條件為:42°C 60 min, 70°C 15 min, 4°C 30 min。qRT-PCR使用Bio-Rad iQ5實時PCR係統中的TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒(Applied Biosystems)進行，並分別使用U6或β-作用作為miR-222-3p和CD4的內源性對照。反應進行了三次。擴增miR-222-3p的熱循環條件為:95°C 30 s, 95°C 5 s, 60°C 30 s, 45個循環，60°C 1 min。同時，擴增CD4的熱循環條件為:95°C, 30 s, 95°C, 5 s, 57°C, 20 s, 45個循環，60°C, 1 min [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．qRT-PCR實驗結束後，測定三個重複反應的循環閾值(Ct)的平均值。數據分析采用2gydF4y2Ba^{——ΔΔgydF4y2Ba}Ct方法。gydF4y2Ba

支原體lamp的提取gydF4y2Ba

的gydF4y2BaM.pneumoniaegydF4y2Ba標準菌株M129(南華大學醫學院病原生物學研究所)用PPLO肉湯培養基(BD Biosciences)在37℃下培養5 ~ 7天。當培養基顏色變為橙色或黃色時，我們將足夠數量的菌液轉移到新的PPLO肉湯培養基中進行擴增培養，當培養基顏色變為橙色甚至黃色bu時，我們收集新的菌液。天氣晴朗，沒有陰雲。生長到對數相的MP培養基在無菌離心管中離心，4°C, 14000 rpm，離心20分鍾。加入Triton X-114。混合後，丟棄上水相，重複，加入2.5倍體積的無水乙醇，- 20℃過夜，丟棄上清液，重新懸浮PBS懸浮液，低速離心後的LAMP懸浮液和上清液，分裝在EP管中，最後使用增增型BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime Biotech)檢測LAMP濃度。gydF4y2Ba

miR-222-3p和CD4在lamp刺激的THP-1細胞中的表達gydF4y2Ba

THP-1細胞密度為1 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba細胞/ml在RPMI 1640培養基(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)中培養，達到指數級生長後收獲並離心。得到的細胞球懸浮在無血清培養基中，1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba細胞分布在24孔板上。在孔中加入不同濃度的lamp (2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml)， THP-1細胞與lamp共培養16 h;對照組用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)代替lamp治療。收集THP-1細胞，采用real-time PCR檢測miR-222-3p和CD4。gydF4y2Ba

miR-222-3p在lamp刺激小鼠BALF中的表達gydF4y2Ba

8周齡雄性BABL/c小鼠購於中國科學院。所有動物研究均經蘇州大學動物保護與使用委員會批準，並符合動物福利法。本研究中采用的方法是按照批準的指南進行的。簡單地說，老鼠被隨機分為兩組(gydF4y2BangydF4y2Ba=每組5個):1)鹽水對照組，2)LAMP刺激組。每隻小鼠鼻內滴注lamp或生理鹽水50 μg。吸入lamp 48 h後結束實驗，隨後采集肺組織。這項體內研究在兩個獨立的實驗中進行。使用先前描述的方法收集BALF樣本和肺組織[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．收集的液體以500倍離心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下加熱2分鍾。將Trizol添加到生成的顆粒中，然後在−80°C保存，然後收集miR-222-3p和CD4，如前所述，通過實時PCR檢測。同時將肺固定於4%多聚甲醛PBS中，石蠟包埋。用蘇木精和伊紅染色4 μm大小的肺切片進行形態學評價。gydF4y2Ba

MPP兒童的人口學資料和臨床特征gydF4y2Ba

本研究共納入36例MPP患兒和27例選擇性手術對照組患兒。如表所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba、絕對中性粒細胞、CRP、LDH、CD3含量gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD56gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNK細胞和CD19gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD23gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba與對照組相比，MPP患兒的B細胞均顯著增加gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

微陣列分析的總miRNAs分析gydF4y2Ba

通過微陣列分析對照兒童和MPP兒童的血漿生成熱圖。與對照組相比，MPP患兒血漿中有26個差異表達的mirna，差異為>的2倍;其中19個miRNAs表達上調，7個miRNAs表達下調(圖2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

MPP病例與對照組之間miR-222-3p和CD4水平的比較gydF4y2Ba

根據Target Scan 7.1數據庫，CD4是miR-222-3p的直接靶標之一。MPP患兒外周血單個核細胞miR-222-3p水平明顯高於對照組(相對表達1.5±0.2 vs. 1.0±0.2)，CD4 mRNA水平明顯低於對照組(相對表達0.5±0.2 vs. 1.0±0.4)(圖2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。同時，伴有胸腔積液的MPP患者miR-222-3p水平高於無胸腔積液的MPP患者;但兩組間CD4 mRNA水平無差異(圖2)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。miR-222-3p與CD4表達無相關性(gydF4y2BargydF4y2Ba=−0.231，gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.175)。gydF4y2Ba

miR-222-3p和CD4 mRNA在lamp刺激的THP-1細胞中的表達gydF4y2Ba

巨噬細胞在過度炎症引起的gydF4y2Bam .肺炎gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．在此基礎上，我們用lamp刺激THP-1細胞gydF4y2Bam .肺炎gydF4y2Ba探討miR-222-3p和CD4 mRNA的體外表達gydF4y2Bam .肺炎gydF4y2Ba-刺激單核細胞。經lamp刺激後，THP-1細胞表達的miR-222-3p水平呈劑量依賴性升高(圖。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)。此外，miR-222-3p水平與LAMP濃度呈正相關(圖。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。相反，LAMP刺激後THP-1細胞CD4水平呈劑量依賴性下降。gydF4y2Ba

miR-222-3p在lamp刺激小鼠BALF中的表達gydF4y2Ba

為了確定miR-222-3p在BALF中的體內表達，我們使用來自肺炎分枝杆菌的lamp刺激BALB/c小鼠的肺。與對照組相比，lamp刺激小鼠細支氣管周圍發現大量炎症細胞浸潤(圖。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。此外，lamp刺激小鼠BALF中的miR-222-3p水平明顯高於鹽水處理對照組(圖2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

m .肺炎gydF4y2Ba是CAP的主要原因，過度炎症在其疾病嚴重程度中起重要作用[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．然而，過度炎症的機製和病理尚不完全清楚。據我們所知，這是第一個探索MPP兒童miRNA表達的研究。在這裏，我們發現MPP患兒外周血單個核細胞中miR-222-3p水平顯著升高，CD4 mRNA水平顯著降低。在體內和體外，miR-222-3p均可由lamp刺激誘導gydF4y2Bam .肺炎gydF4y2Ba．此外，有胸腔積液的兒童miR-222-3p水平高於無胸腔積液的兒童。gydF4y2Ba

多種細胞參與炎症反應，包括巨噬細胞、淋巴細胞、支氣管上皮細胞和中性粒細胞。巨噬細胞是必不可少的清除gydF4y2Bam .肺炎gydF4y2Ba來自肺部，它們在gydF4y2Bam .肺炎gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．此外，巨噬細胞是異質免疫細胞，具有不同的起源、表型、功能和組織定位[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．它們對微生物感染的易感性取決於它們的分化和炎症狀態的變化，部分原因是調控mirna [gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．例如，miR-125a-3p通過下調NF1和Bcl-2促進THP-1巨噬細胞分化和凋亡[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．MiR-125b和let7b可調節巨噬細胞細胞因子的產生，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．此外，miR-155和miR-146a形成了一個複雜的交叉調控網絡，控製巨噬細胞中的基因轉錄，以調節炎症反應[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

以往關於miR-222調控巨噬細胞的研究主要集中在其在腫瘤中的作用[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．最近，Lodge通過熒光素酶檢測發現CD4是miR-222的直接靶點，並報道了miR-222 mimics在人巨噬細胞中的異位表達同時降低CD4 mRNA和細胞表麵CD4，從而導致病毒感染[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．此外，觀察到TNF-α處理的巨噬細胞CD4的下降主要是由於miR-222的誘導[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．在我們之前的研究中，我們發現肺炎支原體肺炎受試者的TNF-α水平明顯較高[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．綜上所述，假設肺炎分枝杆菌可以通過lamp或促炎細胞因子如TNF-α誘導miR-222在巨噬細胞中的表達，高表達miR-222隨後降低CD4，而CD4與巨噬細胞功能相關。gydF4y2Ba

應該注意到這項研究的一些局限性。首先，樣本量小可能導致研究偏倚，有必要增加樣本量以驗證臨床結果。其次，CD4作為miR-222-3p的靶點被TargetScan數據庫預測，但未被熒光素酶測定證實。gydF4y2Ba

小樣本研究證明了這一點gydF4y2BaM.pneumoniaegydF4y2Ba或其lamp可以增加巨噬細胞的miR-222-3p，降低CD4，無論是體外還是體內。因此，miR-222-3p可能是一種對診斷和預後有用的MPP生物標誌物。在未來的研究中，將收集更大的樣本，以驗證高表達的microrna-222-3p如何調節單核細胞的炎症表達，從而在兒童肺炎支原體中發揮作用。gydF4y2Ba

所有數據均可用。gydF4y2Ba

BALF:gydF4y2Ba

支氣管肺泡灌洗液gydF4y2Ba

帽子:gydF4y2Ba

社區獲得性肺炎gydF4y2Ba

卡:gydF4y2Ba

社區獲得性呼吸窘迫綜合征gydF4y2Ba

CD4:gydF4y2Ba

分化群4gydF4y2Ba

c反應蛋白:gydF4y2Ba

c反應蛋白gydF4y2Ba

燈:gydF4y2Ba

脂相關膜蛋白gydF4y2Ba

LDH:gydF4y2Ba

乳酸脫氫酶gydF4y2Ba

mir - 222 - 3 - p:gydF4y2Ba

微rna - 222 - 3 - pgydF4y2Ba

microrna:gydF4y2Ba

微rnagydF4y2Ba

MPP:gydF4y2Ba

肺炎支原體肺炎gydF4y2Ba

聚合酶鏈反應:gydF4y2Ba

聚合酶鏈反應gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

實時定量PCRgydF4y2Ba

白細胞:gydF4y2Ba

白細胞gydF4y2Ba

我們感謝參與這項研究的兒童以及他們的父母和監護人同意他們參與。我們還要感謝Edanz編輯中國Liwen Bianji的Katie Oakley博士(gydF4y2Bawww.liwenbianji.cn/acgydF4y2Ba)，以編輯本手稿草稿的英文文本。gydF4y2Ba

本研究由蘇州市社區發展科技計劃項目(No.;SS201535)。gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

1. 褚楚和雷曉麗對這項工作同樣做出了貢獻。gydF4y2Ba

作者及隸屬關係gydF4y2Ba

1. 蘇州大學附屬兒童醫院傳染病科，江蘇蘇州215123gydF4y2Ba

   朱楚，雷曉麗，李玉琴，羅亞麗，丁穎，周衛芳gydF4y2Ba

2. 蘇州大學附屬兒童醫院呼吸內科，江蘇蘇州215123gydF4y2Ba

   魏記gydF4y2Ba

貢獻gydF4y2Ba

CC:進行分子遺傳學研究，參與序列比對並撰寫稿件。XL:進行分子遺傳學研究，參與序列比對。YL:進行分子遺傳學研究。YD:起草稿件。WZ:實驗的設計和手稿的起草。WJ:實驗的設計和手稿的起草。所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。gydF4y2Ba

相應的作者gydF4y2Ba

對應到gydF4y2Ba濰坊周gydF4y2Ba或gydF4y2Ba魏記gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

倫理批準並同意參與gydF4y2Ba

本研究經蘇州大學兒童醫院機構人文倫理委員會批準進行。所有參與本研究的受試者或監護人均獲得知情同意。gydF4y2Ba

發表同意書gydF4y2Ba

所有作者都已閱讀並批準了內容，並同意將其提交到期刊上發表。gydF4y2Ba

相互競爭的利益gydF4y2Ba

作者宣稱他們之間沒有利益衝突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

beplay外围下载施普林格自然對出版的地圖和機構從屬關係中的管轄權主張保持中立。gydF4y2Ba

開放獲取gydF4y2Ba本文根據創作共用屬性4.0國際許可協議(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是您對原作者和來源給予適當的讚揚，提供到創作共用許可證的鏈接，並注明是否進行了更改。創作共用公共領域奉獻棄權書(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有說明外，適用於本條所提供的資料。gydF4y2Ba

轉載及權限gydF4y2Ba