TLR2缺失促進IgE，抑製卵白蛋白致敏後IgG1類切換

背景

探討toll樣受體(TLR)2在卵白蛋白(OVA)致敏後Th2細胞因子產生和免疫球蛋白(Ig)類切換中的作用。

方法

TLR2^−−/野生型C57BL/6小鼠腹腔注射OVA致敏。用蘇木精和伊紅染色評價肺病理。通過RT-PCR檢測肺中白細胞介素(IL)4、IL5、IL13和IL21轉錄物的豐度。采用酶聯免疫吸附法定量檢測ova特異性IgG1、IgG2a、IgG2b、IgE和IgM。免疫組化染色檢測肺組織中磷酸化的信號換能器和轉錄激活因子(STAT)3，免疫熒光染色檢測核因子(NF) κB活化。隱丹參酮(CPT)可抑製STAT3激活。種係轉錄本(Iμ- c μ、Iγ-Cγ、Iα-Cα或Iε-Cε)、重組後轉錄本(Iμ- c γ、Iμ- c α或Iμ- Cε)和成熟轉錄本(V_HDJ_HV - cγ,_HDJ_H-Cα或V_HDJ_H-Cε)從ova致敏野生型小鼠(加或不加CPT治療)的脾B細胞和TLR2中分析^−−/小鼠(加或不加IL21治療)。

結果

TLR2的肺^−−/OVA致敏後小鼠的炎症程度較野生型小鼠低。在OVA致敏後，TLR2中IL4、IL13和IL21的水平顯著降低，而IL5則沒有^−−/與野生型小鼠相比。此外，在TLR2中，ova特異性IgG1和IgE滴度分別顯著降低和升高^−−/老鼠。TLR2缺乏抑製STAT3的激活，但NF-κB p65的激活無效。CPT治療通過抑製Stat3磷酸化降低IgG1滴度。TLR2敲除和CPT處理均降低了Iγ1-Cγ1、Iγ3-Cγ3和Iα-Cα α α α α轉錄物的頻率，但IL21處理補償了TLR2缺乏的影響。

結論

這些結果提示TLR2可能通過促進IgG1和抑製IL21和STAT3調節的IgE類切換來抑製ova致敏性肺炎症。

哮喘和過敏性疾病已成為發達國家二十一世紀關注的主要公共衛生問題[1］．過敏性疾病的發展涉及兩個階段:致敏和誘導。敏化作用是關鍵的，但延遲，如果能避免敏化，過敏性疾病是可以治愈的。

致敏發病機製中的一個關鍵事件是IgE抗體的產生。IgE在過敏免疫反應中發揮核心作用，是宿主防禦粘膜組織病原體的必要條件[2］．血清和粘膜分泌物中存在其他關鍵免疫球蛋白(Ig)同型，包括IgA、IgM和IgG [3.］．正常情況下，血清中的IgE水平與IgG相比非常低，但在過敏性疾病患者中觀察到IgE水平升高[4］．降低IgE濃度可改變過敏性免疫反應，如在哮喘和高IgE障礙中觀察到的反應[5］．然而，在IgE存在或不存在的情況下，吸入過敏原可引起支氣管炎症[6］．此外，在小鼠模型中，對吸入過敏原的反應，IgE不需要誘導明顯的過敏性氣道炎症。過敏性疾病的典型特征是2型偏倚炎症。越來越多的證據表明，抗原特異性Th2細胞及其細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13協調了過敏性疾病的這些病理特征。在過敏原氣道挑戰之前，給致敏的il4缺陷小鼠注射IL15，而不是過敏原特異性IgE，可恢複嗜酸性粒細胞性氣道炎症[7］．已經確定的是，某些細胞因子調節體外和體內Ig同型轉換，這些細胞因子也刺激種係Ig C_H基因轉錄[8］．在小鼠中，IL4刺激種係γ1和ε-Ig基因轉錄[9，10，11］．IL4和IL13是由Th2細胞產生的密切相關的細胞因子。IL4^−−/和IL4 /使用IL13^−−/小鼠幾乎不產生IgE，並且對ova誘導的腹瀉具有高度抵抗力，而過敏性腹瀉隻有IL13的部分受損^−−/和IL13Ralpha1^−−/老鼠(12］．IL-21是一種多效性細胞因子，可影響B細胞和T細胞效應亞群的激活、分化和擴增。IL21在體內對調節B細胞功能有顯著影響，並與IL4合作[13］．IL21已被證實可以抑製il4誘導的小鼠B細胞產生IgE。IL21R缺乏與磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)和過敏原驅動的IgE水平升高有關，而IgG1和IgG2a水平降低[14］．表麵抗體陽性的B細胞，在這個階段，仍然對過敏原敏感。

核轉錄因子在致敏和抗體產生中起著重要作用。IL4和IL13都能激活轉錄因子6 (STAT6)信號換能器和激活子[15］．Wan等報道il21介導的STAT1磷酸化誘導在CD4中更高⁺來自常染色體顯性高ige綜合征(由STAT3缺陷引起)患者的T細胞，以及來自STAT1功能獲得突變患者的T細胞[16］．

toll樣受體(TLRs)在指導獲得性免疫反應過程中起著關鍵作用。B細胞限製性myd88敲除小鼠肺吸入卵清蛋白(OVA)後，IgE/IgG1產生減少[17］．tlr2特異性配體(肽聚糖除外)在應對ige依賴性激活時增加組胺或白三烯C4的分泌，在應對ige依賴性刺激時增加IL13的分泌[18］．類開關重組(CSR)到特定的Ig同型需要B細胞中的NF-κB轉錄因子。B細胞中的NF-κB成分也受到高度調控，根據B細胞的激活方式可以發生顯著變化[19］．

我們以往的報告[20.表明TLR2基因敲除可以緩解哮喘。在ova致敏和TLR2挑戰的肺中，p38/AKT/ NF-κB p65和磷酸化(p)細胞外信號調節激酶(ERK)水平降低^−−/老鼠。Redecke等人[21]報道了致敏前TLR2的激活會加重實驗性哮喘。然而，在鼻內刺激前立即激活TLR2可減少過敏性氣道炎症[22，23，24，25］．需要更多的工作來了解TLR2在過敏致敏和挑戰中的不同作用。在本研究中，我們研究了細胞因子表達、Ig類切換和核轉錄因子在TLR2致敏OVA中的作用^−−/目的是詳細了解TLR2在OVA致敏中的作用。

小鼠，治療和b細胞分類

6 - 8周齡雄性C57BL/6 (SLACCAS, Shanghai, China)和TLR2^−−/(B6.129-Tlr2^tmIkirNJU南京大學模型動物研究中心，江蘇，中國)小鼠被培育並安置在無病原體的設施中。溫度和濕度分別為18 ~ 22℃和30 ~ 50%，晝夜循環時間為12 h。這些小鼠被隨意提供實驗室水和食物。所有適用的國際、國家和/或機構的動物護理和使用指南都得到了遵守。小鼠腹腔注射100 μg OVA (Sigma, St. Louis, MO, USA)和400 μg Al(OH)致敏。_3.(Sigma, St. Louis, MO, USA)在第0天和第7天使用0.5 mL。對照組小鼠以相同的方式處理，隻是用生理鹽水代替OVA。隱丹參酮(CPT)治療小鼠腹腔注射CPT (Selleck, Houston, TX, USA)溶解在0.5 mL 0.9%生理鹽水中。CPT在每次OVA致敏前30分鍾以200 mg/kg/天的劑量給藥。將1或2 μg mIL21 (Peprotech)溶於0.9%生理鹽水中，分別給藥至選定的TLR2^−−/小鼠(25克/隻，n=每劑量6)在每次OVA敏化之前。

老鼠被CO安樂死₂窒息。老鼠被放置在一個盒子裏，並引入100%的二氧化碳。填充速率約為每分鍾腔體體積的20%。使用標準的解剖技術收集脾髒，並放置在組織培養級六孔板的孔中，包含2ml冷RPMI培養基在冰上。在兩個無菌載玻片的磨砂端之間物理分離脾髒，分離脾細胞。將1-2 mL的RPMI培養基移液到載玻片上，將細胞從載玻片上洗掉。用40 μm細胞濾網過濾細胞，在430×g溫度4°C下離心5 min製成顆粒細胞。取上清，與紅細胞裂解緩衝液(BD, 0.5 mL /脾)在冰上孵育5分鍾。通過加入冷PBS來終止裂解反應。用移液管去除沉澱的細胞碎片，將含有脾細胞的上清轉移到新的管中，注意避免細胞碎片轉移。 The tube was centrifuged at 430×g at 4 °C for 5 min and resuspended in PBS containing 1% (v/v) fetal bovine serum. Cells were counted using a hemocytometer and normalized to 10⁸細胞/毫升。每個細胞樣本與以下抗體在4°C孵育25分鍾:CD45-PE, CD4-FITC和CD45R/B220-APC(均來自eBioscience)。洗滌後，CD45⁺CD4⁻CD45R / B220⁺細胞分類收集(BD)進行RNA提取。

實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)

按照製造商的協議，使用Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取肺組織或b細胞RNA。簡單地說，使用1 μg總RNA根據製造商的協議進行逆轉錄(Takara RNA PCR試劑盒，滋賀，日本)。用RT-PCR (ABI PRISM7500, USA)分析和擴增得到的cDNA。20 μL的反應包括2 μL cDNA、10 μL SYBR Green I Master (Roche, Mannheim, Germany)和各1 μL正向反向引物。反應在95°C孵育10分鍾，然後進行30個循環95°C孵育15 s, 60°C孵育15 s, 72°C孵育30 s。所有樣品均為三份。通過比較閾值周期數(Ct)對轉錄本進行定量分析。所有引物的序列見表1．β-肌動蛋白作為內部對照。我們選擇比較Ct (ΔCt)定量方法來定量轉錄本豐度。CSR種係轉錄本、重組後轉錄本和成熟轉錄本使用前麵描述的引物進行RT-PCR檢測(Pone et al. 2012)。

肺組織、免疫熒光和免疫組化

小鼠肺組織用10%中性福爾馬林浸泡至肺葉分離，石蠟包埋，切成3 μm厚切片，蘇木精、伊紅染色。

組織切片脫蠟，再水化，並通過加熱進行抗原提取。切片在3% (v/v) H中孵育₂O₂浸泡10分鍾，然後在牛血清白蛋白溶液中浸泡1小時。然後在4℃下加入抗NF-κB p65 (1:200, Santa Cruz biotechnology, San Francisco, USA)或p-STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)的原抗。次日，在室溫下加入二抗(pe偶聯驢抗山羊IgG, 1:1000，中國上海Beyotime或山羊抗鼠/兔IgG, GK5005，中國上海Gene Tech) 0.5-1 h。加入DAPI 10 min。用STAT3孵育的組織切片用蘇木精染色40 s，然後脫水密封。使用奧林巴斯顯微鏡觀察和拍攝樣本。

ELISA法測定血清ova特異性Ig和Ig亞類

讓血液樣本凝結至少60分鍾，然後在400×g離心10分鍾。取血清進行IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA、IgE、IgM分析。根據製造商說明，使用固相間接ELISA試劑盒(Chondrex, Redmond, WA, USA)估計血清Ig含量。每個標準品和樣品進行三次試驗。在450nm處使用ELISA平板讀取器測量吸光度(Labsystems, MultiskanEX，芬蘭)。結果以克/升表示。

統計分析

所有數據均以均數±標準差表示。采用方差分析對多個比較進行分析。t檢驗用於評估組間差異。假設有統計學意義P< 0.05。采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。

TLR2敲除可減輕OVA致敏引起的肺炎症

如圖所示。1即TLR2的肺^−−/與野生型小鼠相比，OVA致敏後小鼠的炎症細胞浸潤更少。1a).在TLR2中，OVA致敏誘導的IL4和IL13水平顯著降低^−−/老鼠(圖。1b).野生型和TLR2在OVA致敏後均上調IL6和IL21^−−/老鼠。然而,TLR2^−−/小鼠在OVA致敏反應中IL21上調減少。野生型與TLR2之間IL5表達無明顯差異^−−/小鼠與OVA治療無關。

TLR2^−−/小鼠血清中ova特異性IgG滴度降低₁但在OVA致敏後，OVA特異性IgE滴度增加

野生型小鼠產生了ova特異性IgG的血清滴度₁(無花果。2(1)),免疫球蛋白₂(無花果。2(3)),免疫球蛋白_{2 b}(無花果。2(5))， IgM(圖。2(4))和IgE(圖4。2(6) OVA敏化後。。IgG滴度最高₁和IgM。ova特異性IgG滴度₁是ova特異性IgE的14萬倍。TLR2^−−/小鼠產生了ova特異性IgG的血清滴度₁,免疫球蛋白_{2 b}OVA致敏後IgM和IgE的變化。與卵巢癌致敏野生型小鼠相比，卵巢癌致敏TLR2^−−/小鼠血清中ova特異性IgG滴度降低₁(> 30萬ng/mL vs 20萬ng/mL)但血清中ova特異性IgE滴度增加(2 vs 9 ng/mL)。

在野生型和TLR2中，OVA致敏均未激活NF-κB^−−/老鼠

如圖所示。3.NF-κB p65(紅色)位於野生型小鼠肺核(藍色)外;因此，在OVA致敏後，NF-κB不被激活，也不轉移到細胞核。不出所料，在TLR2中也得到了類似的結果^−−/老鼠。因此，在TLR2中觀察到下肺炎症^−−/並不是由於NF-κB激活的差異。

TLR2^−−/小鼠在OVA致敏後顯示肺中STAT3磷酸化降低(圖。4）

在ova致敏野生型小鼠肺中，15%的上皮細胞p-STAT3染色陽性，而在ova致敏TLR2肺中^−−/小鼠的上皮細胞中p- stat3陽性僅占9.8%。與卵巢癌致敏野生型小鼠相比，卵巢癌致敏TLR2肺中p- stat3陽性細胞的數量^−−/小鼠明顯降低。

CPT可抑製ova致敏野生型小鼠肺上皮細胞中p-STAT3的表達，降低血清中ova特異性IgG滴度₁，減輕肺部炎症(圖。5）

用STAT3抑製劑CPT3治療野生型小鼠導致p-STAT3陽性肺上皮細胞的頻率下降(從15%到6%)，ova特異性IgG下降75%₁(從320 μg/mL到大約80 μg/mL)。CPT治療大大減輕了肺部炎症和充血。

cpt處理的來自野生型小鼠的脾b細胞和來自TLR2的脾b細胞^−−/小鼠的種係轉錄水平較低，而添加IL21逆轉了這種轉錄水平。6）

種係轉錄本(Iμ-Cμ、Iα-Cα、Iε-Cε、Iγ1-Cγ1、Iγ2a-Cγ2a或Iγ3-Cγ3)、重組後轉錄本(Iμ-Cγ、Iμ-Cα或Iμ-Cε)和成熟轉錄本(V_HDJ_HV - cγ,_HDJ_H-Cα或V_HDJ_H-Cε)。CPT處理野生型小鼠和TLR2敲除均能使脾B細胞中種係Iα-Cα、Iγ1-Cγ1、Iγ3-Cγ3轉錄物幾乎完全失效。每隻小鼠劑量為1 μg IL21可恢複Iα-Cα、Iγ1-Cγ1和Iγ3-Cγ3的表達;劑量為2 μg IL21可促進Iα-Cα α、Iγ1-Cγ1和Iγ3-Cγ3的表達。但兩組均未檢出Iε-Cε轉錄本。

我們的結果顯示，在野生型小鼠中，OVA致敏後炎症細胞浸潤氣道明顯，主要包括淋巴細胞和嗜酸性粒細胞。與NS治療的小鼠相比，ova致敏小鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞比例降低，嗜酸性粒細胞數量增加。OVA致敏後，Th2細胞因子(IL4和IL13)表達顯著上調，而IL5表達無明顯差異。野生型小鼠在OVA致敏後，血清中OVA特異性IgG1、IgA、IgG2a、IgG2b、IgM和IgE滴度顯著升高。這些結果表明OVA致敏促進炎症反應。

TLR2中幾乎檢測不到IL4、IL13和IL21的表達^−−/小鼠與OVA治療無關。血清中ova特異性IgE和IgG1滴度在TLR2中升高^−−/用OVA刺激後的小鼠與NS比較。然而，ova致敏TLR2^−−/與ova致敏野生型小鼠相比，小鼠血清中ova特異性IgE滴度較高，但血清中ova特異性IgG1滴度較低。IL21亞型表達模式與IL21不同，在TLR2中表達上調幅度更大^−−/OVA致敏小鼠與野生型小鼠比較。Nara等報道IL21亞型具有與IL21相似的功能:它可以促進STAT3的磷酸化，但很少從細胞分泌，因此主要具有自分泌功能[26］．IL21是Th17細胞的產物[27]，與脾髒或淋巴結中的B細胞共定位[28]，因此提示隻有IL21而沒有IL21亞型作用於B細胞。劉等人。[29]研究了IL21與TLR7/8或9激動劑聯合使用的效果，發現IL21可以通過增強STAT3的磷酸化和促進IgG的產生來增加人B細胞中TLR-MyD88-STAT3通路的活性。TLR2與TLR7/8或9在促進小鼠脾B細胞IgG1種係轉錄和分泌方麵具有類似的協同作用。這些結果提示TLR2中IL21的下調^−−/在ova致敏的TLR2中，小鼠可能負責提高ova特異性IgE的血清效價和降低ova特異性IgG1的血清效價^−−/老鼠(13］．

IgE在早期哮喘反應中起核心作用，可與過敏原結合，引起肥大細胞或嗜堿性粒細胞脫顆粒，引發炎症。炎症介質引起粘膜水腫、平滑肌收縮和腺體分泌物增加，引發過敏性炎症反應。抗IgE治療通過減少可與效應細胞結合的遊離IgE的數量而削弱其作用[30.］．然而，治療反應在個體間差異很大[31］．除了引起致敏和過敏性哮喘的抗體同型IgE外，對常見吸入性過敏原的免疫反應還包括IgG。OVA/OVA小鼠支氣管肺泡灌洗液含有150 mg/mL的OVA特異性IgG和8.93 mg/mL的OVA特異性IgE [32］．此外，有研究認為IgG1與Th2反應密切相關[33，34，35，36］．因此，在我們的研究中，低ova誘導TLR2的肺炎症^−−/小鼠可能歸因於IgG1滴度降低。

卵巢癌致敏TLR2肺中p- stat3陽性細胞的頻率明顯降低^−−/與ova致敏野生型小鼠比較。然而，在兩種TLR2的OVA致敏後，NF-κB均未被激活^−−/或者野生型小鼠。與Bieneman等人的工作一致。[18]、NF-κB不參與TLR2的反應^−−/在野生型小鼠中，OVA對NF-κB無活化作用。STAT3在體外可被IL21激活，可直接結合IL21啟動子，在自分泌正反饋回路中誘導IL21表達[37］．然而，NF-κB在OVA致敏和引發炎症中發揮作用，如我們之前的報道所述[20.］．因此，明顯存在OVA致敏和引起炎症的OVA致敏之間的區別。因此，STAT3水平的降低導致了ova致敏TLR2中ova特異性IgG1滴度的降低^−−/老鼠。我們的研究結果顯示，在OVA致敏後，TLR2-Stat3/IL21通路對IgG1和IgE滴度有相反的影響。

從這些數據中有一個問題很明顯:為什麼IL4, IL13在TLR2中幾乎消失了^−−/而不是IL5?Th2產生IL4、IL13和IL5 [38]和肥大細胞[39］．IL-4是一種嗜酸性粒細胞趨化因子，可促進氣道嗜酸性粒細胞的浸潤，並可促進B細胞中IgE的合成、內皮細胞黏附因子-1、肥大細胞生長和杯狀細胞化生。IL4作為T細胞的自分泌生長因子，可促進幼稚T細胞向Th2細胞分化，從而誘導過敏性炎症[40，41，42］．IL-13主要由活化的Th2細胞產生，可與IL-4協同作用促進B細胞合成IgE，激活巨噬細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞，抑製嗜酸性粒細胞凋亡，可調節杯狀細胞。增生和粘液分泌增加促進氣道成纖維細胞向成纖維細胞轉化，導致膠原蛋白沉積;這可促進氣道平滑肌收縮，引起氣道高反應性[43］．IL5也是Th2細胞因子，可誘導嗜酸性粒細胞的激活、遷移、增殖和分化，抑製細胞凋亡。總之，這些數據表明其他類型的免疫細胞介導了TLR2中IL4和IL13的消失^−−/老鼠。德雷克等人[44]發現在b細胞缺陷JH的肺中IL4和IL13的水平明顯較低^−−/用OAAH (OVA，鏈格孢屬，曲黴屬真菌，和室內塵蟎)的含量高於oaah處理的野生型小鼠(p< 0.05)。與IL4或IL13相比，IL5的水平受影響較小。這不是由於TLR2中B細胞發育的抑製^−−/老鼠。相反，TLR2激動劑抑製B細胞的成熟[45］．三項研究報道TLR2在靜息B細胞的增殖、激活和分化中發揮作用[46，47，48］．TLR2敲除可能抑製了B細胞IL4和IL13的激活和分泌。Takeda等人發現嗜酸性粒細胞缺乏小鼠在11次OVA挑戰後支氣管肺泡灌洗液中IL4、IL5和IL13水平升高[49］．因此，嗜酸性粒細胞與TLR2表型無關^−−/老鼠。在缺乏CD11c +樹突狀細胞(DC)的情況下，內源性或過繼轉移的CD4+ Th2細胞對OVA氣溶膠的反應不產生IL4、IL5和IL13 [50］．因此，DCs不太可能介導TLR2的表型^−−/老鼠。Song等人使用2-氯腺腺苷來耗盡肺泡巨噬細胞，發現在OVA刺激下IL4、IL5和IL13水平降低[51］．抑製早期氣道中性粒細胞不影響IL4、IL5和IL13水平[52］．這些現象背後的具體機製有待進一步探討。

在本研究中，無論OVA是否致敏，均未檢測到Iε-Cε轉錄本。與其他Ig同型不同，免疫後IgE同型轉換和產生IgE的B細胞擴張發生在引流淋巴結，而不是脾髒[53］．在TLR2的淋巴結中不能檢測到種係、重組後和成熟轉錄物^−−/用IL21治療的小鼠。這應該在未來的研究中加以檢驗。

總之，在ova致敏的TLR2中，IL4、IL13和IL21幾乎消失^−−/與野生型小鼠比較。然而，在OVA致敏TLR2中，調控Ig類切換和產生的轉錄因子是IL21^−−/小鼠是STAT3，而不是NF-κB。這些發現為過敏性疾病的預防和治療提供了潛在的靶點。

數據共享不適用於本文，因為在當前的研究中沒有生成或分析數據集。

TLR:

toll樣受體

搞笑:

免疫球蛋白

卵巢:

卵清蛋白

IL:

白介素

統計:

信號換能器和轉錄激活器

尼克-弗瑞:

核轉錄因子

CPT:

Cryptotanshinone

PBS:

磷酸鹽

企業社會責任:

類開關重組

病人:

磷酸化

兵:

細胞外信號調節激酶

NS:

生理鹽水

感謝Edanz中國編輯李文·卞吉(www.liwenbianji.cn/ac)，以編輯本手稿草稿的英文文本。

本研究的設計、數據收集和分析得到了國家自然科學基金項目(No.81570016)和江蘇省衛計委項目(H201622)的資助。本研究的數據解讀、稿件準備及出版費用由蘇州市科技計劃項目(批準號:SS201535)。作者對本出版物的內容負責。

作者指出

1. 李玉琴和陳秋對這項工作做出了同樣的貢獻。

作者和隸屬關係

1. 蘇州大學兒童醫院，蘇州215003

   李玉琴，季偉，範玉傑，黃莉，褚楚，周衛芳

2. 蘇州大學放射醫學與防護學院，江蘇蘇州215123

   邱陳

貢獻

所有作者都貢獻了稿件的想法。YL和QC對這項工作貢獻相同。YL進行了ELISA、PCR和肺組織學、免疫熒光和免疫組化。QC, WJ, YF, LH, CC, WZ參與了研究的設計，並幫助起草和修改了稿件。QC和YL構思了這項研究，並參與了它的設計和協調，並幫助撰寫了手稿。所有作者閱讀並批準了最終稿件。

相應的作者

對應到楚楚或濰坊周．

倫理批準和同意參與

該項目獲得了蘇州大學兒童醫院倫理委員會的批準。

發表同意書

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

beplay外围下载施普林格自然對出版的地圖和機構附屬的管轄權要求保持中立。

開放獲取本文遵循創作共用署名4.0國際許可協議(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，該協議允許在任何媒體或格式中使用、分享、改編、分發和複製，隻要您給予原作者和來源適當的署名，提供創作共用許可協議的鏈接，並說明是否有更改。本文中的圖片或其他第三方材料包含在文章的創作共用許可中，除非在材料的信用額度中另有說明。如果材料不包含在文章的創作共用許可中，並且您的預期用途不被法律法規允許或超出了允許的用途，您將需要直接從版權所有者那裏獲得許可。欲查看此許可證的副本，請訪問http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．創作共用公共領域奉獻放棄書(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)適用於本文提供的數據，除非在數據的信用額度中另有說明。

轉載及權限