健康早產兒和足月新生兒動脈臍帶血葉黃素水平與神經營養鈣結合S100B蛋白相關

背景

S100B是一種已知的大腦發育和損傷的生物標誌物。葉黃素(LT)是一種天然存在的葉黃素類胡蘿卜素，主要集中在中樞神經係統(CNS)中，但其神經營養作用仍有爭議。我們在早產兒和足月健康新生兒隊列中研究了LT臍血濃度是否與S100B相關。

方法

我們對健康早產兒臍帶血中LT和S100B的分布進行了前瞻性研究。n= 50)和期限(n= 50)新生兒。

結果

S100B和LT表現出較高的濃度(P在孕33-36周(GA)時均< 0.01，隨後逐漸減少(P< 0.01，所有)從37歲開始，定期下降。S100B和LT均具有顯著的性別依賴性(P早產兒組和足月組女性血清中均< 0.01)水平較高。S100B (R= 0.68;P< 0.001)和LT (R= 0.40;P= 0.005)與采樣時GA相關。顯著正相關(R= 0.87;PS100B與LT之間< 0.001)。

結論

目前的數據顯示S100B和LT之間的相關性支持LT在中樞神經係統中的營養作用的概念。需要對高危嬰兒進行進一步的研究，以闡明LT參與導致中樞神經係統發育和損傷的病理生理級聯事件。

S100B是EF-hand家族的一種腦特異性酸性鈣結合蛋白，主要集中在膠質細胞和神經元亞群中[beplay3体育 ］．有證據表明，該蛋白是中樞神經係統(CNS)生長和損傷的鞏固標記物，模擬Janus臉:當S100B被分泌時，被認為在生理(納米摩爾)濃度下具有旁分泌/自分泌營養效應，在更高(微摩爾)濃度下具有神經毒性效應[beplay3体育 ］．

在胎兒、新生兒和兒科患者的不同生物液體(即羊水、腦脊液、血液、尿液、唾液和牛奶)中，S100B與提示中樞神經係統發育和損傷的臨床、實驗室和放射學參數相關[2，3.，4，5，6，7，8，beplay3体育 ］．

在過去的十年中，食品和藥物管理局(FDA)，歐洲醫療機構(EMA)和最近的國家衛生研究所(NIH)支持圍產期神經生物標誌物(NB)的研究。目的是鼓勵NB在藥物開發中的整合及其在臨床實踐中的適當使用，促進NB的資格認證項目[beplay3体育 ］．

在不同的新NB中，葉黃素(LT)是一種未被人類合成的天然類葉黃素類胡蘿卜素。在生物體液和組織中LT濃度取決於每日的飲食攝入量，因為在水果和蔬菜(如菠菜和羽衣甘藍)中LT含量很高[11，12，13，beplay3体育 ］．在圍產期，LT已被證明高度集中在不同的生物液體(血液和人乳)和中樞神經係統特定區域(即神經視網膜、額葉、枕葉皮層和海馬)[15，16，17，beplay3体育 ］．在這方麵，LT已被證明通過一種尚不清楚的機製參與中樞神經係統的發育[beplay3体育 ，beplay3体育 ］．LT營養作用的臨床和生化相關性表明:LT營養作用與健康早產/足月新生兒胎齡(GA)和性別有關;後者含有鞏固的腦生長因子，如激活素a [beplay3体育 ］．

因此，本研究旨在研究健康早產兒和足月嬰兒LT動脈臍帶血水平是否與S100B相關，從而支持其中樞神經營養作用。

人口

當地倫理委員會批準了研究方案，並獲得了所有患者父母的知情和簽字同意。

我們招募了100名連續健康懷孕(早產)的婦女n= 50;術語n= 50)，在33之間交付^{+ 6 d}41^{+ 6 d}孕周(圖4)beplay3体育 ）.

GA由臨床資料和妊娠前三個月的超聲檢查確定。適當生長的定義如下:i)雙頂骨直徑和腹圍在10^th-90年^th與坎貝爾和托馬斯達成協議的厘位[beplay3体育 )和出生體重(BW)之間的10^th-90年^th根據我們的人口標準，在修正了母親的身高、體重、胎次和新生兒的性別後[beplay3体育 ］．早產兒和足月新生兒分別在37 GA之前和37 GA之後出生。我們的研究隻包括表現出以下圍產期結果的早產兒和足月嬰兒:無產婦疾病;無胎兒窘迫跡象;臍帶血或靜脈血中pH值> 7.2;Apgar評分在1-5分鍾> 7。

排除標準為:母體是否有中樞神經係統疾病、多胎妊娠、宮內發育遲緩、妊娠高血壓、糖尿病和感染、任何胎兒畸形、染色體異常、圍產期窒息和難產。

在出生時采集動脈臍帶血樣本，以評估標準實驗室監測參數S100B和LT。所有用於測量NB的樣本分別在900 g (S100B)和2500 g (LT)離心，並保存在−70℃。

神經係統檢查

根據Prechtl的定性方法，住院期間每天進行神經係統檢查[beplay3体育 該研究將每個嬰兒分為三個診斷組:正常、可疑或異常。當出現一種或多種神經係統綜合征時，如運動過度或運動不足、運動過度或運動不足、腦半球綜合征、冷漠和高興奮性綜合征，則認為嬰兒異常。如果沒有確定的綜合征或隻有孤立的症狀出現，則將嬰兒歸類為可疑嬰兒。神經係統檢查由一名檢查者進行，該檢查者對NB結果不知情。

S100B測量

根據製造商說明，使用免疫發光法(Liaison S100, Dietzenbach, Germany)測定S100B水平。該方法的檢出限為0.02 μg/L，濃度為0.09 ~ 18.9 μg/L時，檢測內變異係數≤2.8%，檢測間變異係數≤5.3%。

葉黃素測量

采用先前報道的分析條件進行LT提取和高效液相色譜(HPLC)分析[beplay3体育 ，beplay3体育 ］．取500 μL血清，用500 μL乙醇(1% BHT)處理，析出蛋白質顆粒。用500 μL己烷分別提取水乙醇餾分和球團兩次。將含有血清類胡蘿卜素的己烷組分組合，在氮氣下蒸發，在50 μL氯仿中溶解，然後進行HPLC分析。LT的色譜分離是在lc - 10ad Shimadzu高效液相色譜係統上進行的，該係統配備了二元泵和柱室，並與uv二極管陣列檢測器耦合。

在developil5 μm rp - aquous C30, 250 × 4,6 mm色譜柱(Phenomenex Torrance, CA, USA)上進行分離，使用先前報道的色譜條件[beplay3体育 ］．采用外標法，建立以LT為參考標準的校準曲線，對LT進行定量。檢出限為0.017 nmol/mL。

采用液相色譜-串聯質譜聯用技術對LT及其代謝物進行鑒定。色譜分離是通過連接兩個微泵200 (Perkin Elmer, Carlsbad, CA, USA)的高效液相色譜進行的，使用相同的色譜柱和相同的色譜條件描述的高效液相色譜分析。

采用API 3000串聯質譜計(API 3000, Applied Biosystem, Waltham, MA, USA)配置大氣壓力化學電離源(APCI)進行質譜分析。質譜儀的最佳設置為:探針溫度500℃，霧化器電流4 μA，聚束電位45 V，聚焦電位300 V。

腦超聲

所有研究人群在出生後72小時內或出院時進行CUS。在預定的監測時間點用實時超聲儀(Acuson 128SP5 Mountain View CA, USA)進行記錄。一名不知道臍帶血檢測結果和臨床數據的檢查官審閱了圖像。腦出血按Papile等標準分類[beplay3体育 ］．

監測參數

所有被招募的嬰兒脈搏動脈氧飽和度(SaO₂)和主要實驗室參數，如紅細胞計數(RBC);血紅蛋白血濃度(Hb);血球容積率(Ht);靜脈血液pH值;部分靜脈二氧化碳壓(pCO₂）;部分靜脈氧壓(pO₂）;基地過剩(是);在進入研究時記錄血離子。

在樣本量計算中，我們使用健康早產兒和足月嬰兒出生時S100B動脈臍帶血濃度的變化作為主要參數[beplay3体育 ］．我們假設S100B降低0.5個標準差(SD)為臨床顯著性。考慮α = 0.05，采用雙側檢驗，我們估計冪為0.95，招募45名早產兒和45名足月嬰兒。我們添加了n=每組5個嬰兒，考慮到退出、交叉和同意退休(圖5)。beplay3体育 ）.

臨床數據報告為均值和標準差。生化數據報告為中位數和四分位間百分位數。兩組間胎兒和新生兒監測參數結果比較采用雙麵Mann-Whitney U檢驗，數據不服從高斯分布時采用Kruskal-Wallis單因素方差分析和Dunn事後檢驗。比例之間的比較用Fisher精確檢驗進行。對S100B、LT、GA的相關性分別進行線性回歸分析。采用Sigma Stat 3.5 (GmBH, Germany)進行統計分析。的值P< 0.05被認為是顯著的。

表格beplay3体育 顯示入組時足月和早產新生兒的產婦和圍產期特征。兩組產婦的年齡、分娩方式和性別具有可比性(P> 0.05，對所有)。

如預期，顯著差異(P早產兒和足月新生兒的GA和BW均< 0.001)。無顯著差異(P> 0.05，均為0.05)在第1分鍾和第5分鍾的Apgar評分，SaO₂主要實驗室參數(RBC、Hb、Ht、靜脈血pH;pCO₂,阿寶₂， BE和血離子)。

神經學檢查和腦超聲模式在兩組間無差異。此外，在出院時，所有接受研究的嬰兒均未檢測到明顯的神經係統綜合征。

S100B蛋白測量

在所有采集的樣本中均可檢測到S100B動脈血水平。S100B濃度模式在GA早期表現為較高水平(P均< 0.01)，峰在33-36 GA (S100B中位數:1.51 μg/mL;25^th-75年^th百分數:1.12 ~ 1.90 μg/mL)，呈逐漸下降的趨勢，在41 GA時呈下降趨勢(S100B中位數:0.60 μg/mL;25^th-75年^th百分位數:0.33 - -0.75μg / mL)。此外，S100B已被發現依賴於GA (R=−0.68;P< 0.001)。

當根據性別校正S100B水平時，我們發現更高(P在早產兒和足月嬰兒中，女性比男性的蛋白質水平均< 0.01。beplay3体育 麵板)。

葉黃素的測量

在所有采集的樣本中，LT動脈血水平均可檢測到。LT在GA早期表現為高濃度(P均< 0.01)，峰值在33-36 GA (LT中位數:82.06 pmol/mL;25^th-75年^th中位數:57.45-133.50 pmol/mL)，隨後從37 GA開始逐漸下降，在42 GA下降較低(LT中位數:57.60 pmol/mL;25^th-75年^th百分位數:42.50 - -65.07 pmol /毫升)。此外，LT還被發現與GA相關(R=−0.40;P= 0.005)。當按性別校正LT水平時，我們發現更高(P在早產兒和足月嬰兒中，女性LT水平均< 0.01)高於男性。beplay3体育 麵板B)。

S100B與葉黃素的相關性

在表beplay3体育 報道了S100B與LT的相關性。有顯著正相關(P當考慮種群總數和GA和性別的亞組時，S100B和LT之間的差異均< 0.05)。

在過去的十年中，出現了一種新的診斷工具的需求，即在日常臨床實踐中納入新的診斷工具，以早期發現有圍產期腦損傷風險的病例[2，3.，beplay3体育 ］．基於此，FDA、EMA和最近的NIH批準將NB如S100B、泛素羧基末端水解酶L1a和膠質纖維酸性蛋白(G-FAP)納入創傷性腦損傷等成人和兒童疾病的臨床方案[beplay3体育 ］．

在圍產期，越來越多的證據表明，中樞神經係統發育和損傷的病理生理級聯事件仍未完全闡明，是研究的主題。最近，研究表明，在一係列NB中，S100B似乎是唯一滿足FDA、EMA和NIH聲明要求的大部分標準的NB [beplay3体育 ，beplay3体育 ，beplay3体育 ］．

在本研究中，我們提供的證據表明，在早產兒和足月健康嬰兒中，動脈臍血LT水平與中樞神經係統發育/損傷的鞏固NB即S100B蛋白相關。此外，LT，如S100B，是GA和性別依賴的，在妊娠晚期(即33-36周)的前幾周檢測到的LT和S100B水平較高，在近期檢測到的LT和S100B水平較低。

LT和S100B均為遺傳且性別依賴的事實與之前的觀察一致[5，6，7，8，beplay3体育 ，beplay3体育 ，beplay3体育 ］．S100B的營養作用並不令人驚訝，因為該蛋白最近被證明符合所有FDA、EMA和NIH的標準。然而，LT的營養作用還遠未完全闡明。結果顯示LT在早產兒晚期(即33^{+ 6 d}-36年^{+ 6 d}wks)模仿S100B模式。這一發現值得進一步考慮，因為在這一時期，大腦的體積、重量和結構都處於最高增長水平[28，29，30.，beplay3体育 ］．特別是:i)磁共振成像(MRI)模式提示在研究階段不同髓鞘化過程的時間和持續時間[beplay3体育 ]， ii) NB生物液中S100B、激活素A、G-FAP等的評價與MRI模式一致，與中樞神經係統的生化、形態和電生理成熟一致[2，3.，beplay3体育 ，beplay3体育 ，beplay3体育 ，beplay3体育 ]，以及iii)健康嬰兒早產兒晚期近紅外光譜圖顯示氧合狀態改善和組織功能增強，提示中樞神經係統發育[32，33，beplay3体育 ］．基於目前的發現，支持LT中樞神經係統的營養作用是合理的。其原因可能在於LT位點的濃度、代謝和信號傳遞作用。特別是LT: i)主要位於中樞神經係統中對學習和記憶至關重要的區域[beplay3体育 ，beplay3体育 ]， ii)與代謝產物(即1-十八醇、磷酸鹽、NADH)相關，該代謝產物參與中樞神經係統發育過程中導致髓鞘化峰值的能量通路[beplay3体育 ，beplay3体育 ，beplay3体育 ]， iii)與參與皮質發育和折疊、少突膠質細胞成熟以及細胞內和細胞-細胞信號傳導的脂肪酸和溶血磷脂有關[36，37，beplay3体育 ]， iv)與神經遞質(即γ-氨基丁酸，天冬氨酸)相關，參與主要中樞神經係統發育級聯事件(即調節神經元增殖和成熟，神經突生長，突觸形成，神經傳遞)[beplay3体育 ，39，40，41，42，beplay3体育 ］．另一方麵，S100B: i)主要集中在中樞神經係統，位於膠質細胞和神經元細胞中[2，3.，beplay3体育 ]， ii)與多巴胺D2受體相互作用，該受體屬於G蛋白偶聯受體家族，具有7個跨膜結構域，廣泛分布於中樞神經細胞[beplay3体育 ]， iii)在細胞外，它與晚期糖基化終產物受體結合，激活幾個細胞內信號通路，如調節蛋白激酶介導的磷酸化，調節酶活性，維持細胞形狀和運動，影響一些信號轉導通路，促進鈣穩態[beplay3体育 ，beplay3体育 )和iv)根據分泌的濃度，它具有營養或毒性作用。在較低濃度(納摩爾)下，S100B被認為能刺激神經元生長和增強神經元存活，而在較高濃度(微摩爾)下，S100B可能通過增加促炎細胞因子IL-6的表達和誘導凋亡神經元死亡而產生有害影響[2，3.，beplay3体育 ］．基於目前的發現，我們有理由認為LT和S100B參與了調節中樞神經係統發育和神經保護的一係列事件。

最後，在本係列中，我們還表明LT和S100B是性別依賴的。考慮到胎兒/新生兒的不同，這一發現值得進一步考慮:i)兩性中樞神經係統發育模式，ii)成熟階段的生長、代謝、激素發育步驟，iii)研究階段的濃度生化和NB模式[2，3.，beplay3体育 ，6，7，beplay3体育 ］．

最後，我們認識到目前的研究有幾個局限性，如:i)招募的人群較少，ii) LT測量技術在可重複性方麵需要授權，iii) NB縱向監測。人們熱切期待著針對上述問題的進一步調查。

總之，目前的結果顯示LT和S100B之間存在相關性，支持了LT潛在的神經營養作用的概念，並為進一步的研究開辟了道路，旨在促進LT在一組可信賴的CNS發育/損傷生物標誌物中發揮作用。

已識別的個人參與者數據將不會公開。

中樞神經係統:

中樞神經係統

食品藥品監督管理局:

食品和藥物管理局

教育津貼:

歐洲藥品局

國家衛生研究院:

國家衛生研究所

注:

Neurobiomarkers

LT:

葉黃素

遺傳算法:

孕齡

BW:

出生體重

高效液相色譜法:

高效液相色譜法

APCI:

大氣壓化學電離

客戶:

腦超聲

聖₂：

脈衝動脈氧飽和度

加拿大皇家銀行:

紅細胞計數

Hb:

血紅蛋白血藥濃度

Ht:

血球容積率

pCO₂：

部分靜脈二氧化碳壓力

阿寶₂：

部分靜脈氧壓

是:

基地過剩

SD:

標準偏差

G-FAP:

膠質纖維酸性蛋白

核磁共振成像:

磁共振成像

這項工作是由意大利新生兒學會主辦的i.o博士國際項目的一部分，並得到了意大利“I Colori della Vita基金會”和“Associazione Gruppo l’insieme”向DG提供的部分贈款的支持。我們感謝意大利薩盧吉亞的哈迪斯奧爾林支持分析套件。

知情同意的聲明

所有參與研究的受試者都獲得了知情同意。

這項工作是由意大利新生兒學會主辦的i.o博士國際項目的一部分，部分由意大利“I Colori della Vita基金會”向DG提供贈款支持。我們感謝意大利薩盧吉亞的哈迪斯奧爾林支持分析套件。

作者和聯係

1. 意大利羅馬波利尼科·卡西利諾總醫院新生兒科和新生兒重症監護室

   西蒙內塔·皮科內和皮爾米歇爾·保利洛

2. 費德裏科二世那不勒斯大學藥學係，意大利那不勒斯

   Alberto Ritieni & Giulia Graziani

3. 新生兒重症監護室，G. d 'Annunzio大學，基耶蒂，意大利

   Ebe D 'Adamo, Valentina Botondi, Daniele Panichi和Diego Gazzolo

4. 意大利基耶蒂大學兒科學係

   Sara Torresi, Daniela David, Armando di Ludovico & Francesco Chiarelli

貢獻

SP、AR、GG、PP、ED’a、VB、DP、ST、DD、ADL和FC對初稿的構思、調查和撰寫都有貢獻。DG在項目的管理、構思、調查、監督和撰寫審查和編輯方麵做出了貢獻。所有作者閱讀並批準了最終稿件。

相應的作者

對應到迭戈Gazzolo．

倫理批準和同意參與

該研究根據《赫爾辛基宣言》的指導方針進行，並得到意大利亞曆山德裏亞ASO SS Antonio, Biagio和C. Arrigo倫理委員會的批準(CoMBINeASO.Neonat17.01)。

同意出版

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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