反複喘息嬰兒和兒童下呼吸道的細菌組成和菌落結構:病例對照研究

背景

人類下呼吸道的細菌負荷至少比身體其他部位低幾倍。本研究旨在鑒別嬰幼兒及反複喘息患兒與支氣管異物患兒下呼吸道細菌組成及菌落結構，明確嬰幼兒喘息時間長短是否會導致下呼吸道細菌菌落結構的差異。

方法

我們收集48例接受纖維支氣管鏡檢查的嬰幼兒肺泡灌洗液標本，將其分為A1組(多次喘息:< 1個月內出現3次以上喘息)、A2組(持續喘息:> 1個月)、B組(支氣管異物;對照組)。我們用高通量測序分析了肺泡灌洗液的細菌群落結構。通過α和β多樣性分析評價微生物群落的豐富度和多樣性。

結果

基於Illumina Nova測序平台共獲得6644個操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)，並根據符合97%識別閾值的OTU進行聚類，然後對OTU序列進行物種注釋。在注釋結果中，屬水平注釋了2608個OTUs(39.25%)。在屬水平上，Sphingomonas而且Phyllobacterium顯著高於b組PhyllobacteriumA2組明顯高於B組。普氏菌，奈瑟氏菌屬,嗜血杆菌B組均高於A1、A2組。α和β多樣性分析組間差異有統計學意義。A1、A2組微生物群落多樣性顯著低於B組，但A1、A2組細菌群落多樣性差異無統計學意義。

結論

嬰兒和兒童的反複喘息更可能是由於整體細菌微生態的改變和宿主呼吸和免疫穩態的破壞，而不是單一細菌的影響。

喘息是兒童，尤其是嬰幼兒常見的呼吸係統症狀，約三分之一的兒童在3歲前至少會發作一次喘息，1-2%的兒童因嚴重呼吸係統症狀住院[1］．一些嬰兒和兒童的喘息隨著年齡的增長而消失，而另一些則發展為持續性喘息或哮喘[2］．嬰兒和兒童的反複喘息通常歸因於呼吸道損傷、炎症和感染、過敏和環境因素引起的免疫反應。然而，很少有報道顯示下呼吸道菌群紊亂是否與嬰兒和兒童反複喘息有關。人類下呼吸道的細菌負荷至少比身體其他部位低幾倍，而且可能具有高度可塑性，易受外力影響[3.，4］．

人類最早對體內共生微生物的描述可以追溯到人類的研究腸杆菌屬在嬰兒的消化道中[5］．幾十年來，微生物組的重要性逐漸得到了認可，從早期對腸道細菌對飲食的反應的描述，到近年來記錄的大量工作中發現的宿主-微生物相互作用的詳細機製，包括影響係統免疫、心血管健康和神經發育的途徑[6，7，8，9］．然而，對肺的細菌群落結構的研究和理解仍然匱乏，因為長期以來，肺被認為是無菌環境，除非被呼吸道致病微生物感染。這一根深蒂固的觀念導致在第一輪人類微生物組計劃(HMP)的采樣名單中刪除了肺[10］．第二輪HMP除了發現細菌外，還在肺部發現了病毒和真菌，但每種微生物對健康和疾病的影響仍然沒有得到很好的理解[11，12，13，14］．

近年來，嬰兒和學齡前兒童反複喘息已變得非常普遍。急診科就診和住院人數的增加對社會和個人都有影響[15］．嬰幼兒反複喘息的預後各不相同，喘息的發作和持續時間有時可能不可避免地與哮喘有關[16，17]，已被證實是由於細菌感染導致肺功能受損所致。鏈球菌引起的肺炎，莫拉克斯氏菌屬複活,而且流感嗜血杆菌微生物群是否主要與哮喘的加重有關[18，19］．然而，目前尚不清楚長時間持續喘息與多次喘息發作是否會引起下呼吸道菌落結構的不同變化。

理想的標本采集方法是從宿主DNA中分離微生物脫氧核糖核酸(DNA)來收集肺組織樣本，但這種方法並不能常規應用於所有疾病。雖然痰標本易於采集，但在采集過程中不可避免地會接觸口腔和上呼吸道。相比之下，支氣管肺泡灌洗液對上呼吸道菌群汙染免疫，並密切模仿下呼吸道的微生物群，但不能完全采樣肺最深處的氣道。支氣管異物是一種典型的兒科急症，通常影響6個月至3歲的嬰兒和兒童。大多數支氣管異物患兒病程較短，氣道的機械損傷不應在這短時間內調整菌群的組成。因此，我們選擇支氣管異物患兒肺泡灌洗液結果，而不是健康嬰幼兒下氣道細菌定植作為對照。

由於持續反複的喘息可能會引起下呼吸道微生物菌落結構的改變，因此應闡明嬰兒和複發性喘息兒童下呼吸道微生物群所代表的屬的差異，為未來深入了解下呼吸道細菌在嬰兒和兒童複發性喘息發展中的關鍵作用提供基礎。

因此，本研究的第一個目的是描述反複喘息患兒下呼吸道細菌菌落的組成和多樣性。第二個目的是確定持續性喘息是否會影響嬰兒和兒童的微生物群落結構和多樣性。第三個目的是確定複發性喘息嬰幼兒的優勢細菌屬，為未來深入了解細菌屬在調節氣道免疫中的作用提供新思路，並為預防導致複發性喘息的疾病提供新方向。

參與者和研究設計

為分析相關細菌群落，從成都市婦女兒童中心醫院收治的支氣管異物或反複喘息患兒的肺泡灌洗液中采集48份標本。參與者被分為A1組(多次喘息:每次都在短時間內重複喘息;n= 13)， A2(持續性喘息:持續喘息1個月以上，既往無喘息;n= 16)， B(支氣管異物:對照組;n= 19)。哮喘組兒童的入選標準為(1)年齡6-36個月;(2)既往喘息≥3次，喘息持續時間< 1個月，或喘息持續時間> 1個月;(3)支氣管鏡及肺泡灌洗;(4) 1周內無抗生素使用史，無心髒病、肺結核、支氣管異物、支氣管肺發育不良、免疫功能異常、影像學檢查異常。B組患兒3天內有異物嗆咳史，支氣管鏡檢查可見異物。

樣品采集和分子分析

肺功能檢查

入院後24 h內完成嬰兒潮肺功能(潮氣量、峰時比、峰容量比、呼吸比)、呼出一氧化氮分數(Fe-NO)、血常規檢查。

支氣管鏡檢查

所有孩子的監護人都簽署了知情同意書。術前常規檢查及相關檢查，禁食4-6小時。支氣管鏡檢查，患者平臥位，靜脈複合麻醉，經聲門麵罩通氣。根據孩子的年齡和體重選擇合適的纖維支氣管鏡(OLYMPUS, Tokyo, Japan)。通過喉罩氣道(LMA)插入支氣管鏡，評估兒童會厭、氣管支、支氣管的每個葉和節段是否有病變。

肺泡灌洗液DNA的提取

采用十二烷基硫酸鈉法提取樣品中的DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度，並進行稀釋。以稀釋後的基因組DNA為模板，使用帶有條形碼的異物，選擇測序區域，使用高保真聚合酶鏈反應(PCR) Master Mix with GC Buffer (New England Biolabs Phusion®，US)和高保真酶進行PCR。擴增區域包括古菌16S V4-V5/古菌16S V8、16S V3-V4/16S V4-V5/ 16sv5 - v7;18S V9和ITS2區域。

PCR產物純化、文庫建設、測序

PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳;PCR定量產物用磁珠純化。采用酶標定量法，將等量PCR產物按濃度混合，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。然後使用凝膠回收試劑盒(Qiagen, Germany)對目標條帶的產品進行回收。該文庫使用無DNA pcr樣品製備試劑盒(TruSeq®，USA)構建。利用量子比特(Qubit)和定量PCR (quantitative PCR)對構建的文庫進行定量，然後用NovaSeq 6000 (Novogene Co.， China Beijing, China)進行測序。

數據處理

使用稀疏算法將所有樣本的有效標記序列聚類為otu, otu默認滿足97%的識別閾值。OTU序列采用Mothur法與SILVA138的小亞單位核糖體核糖核酸(rRNA)數據庫進行物種標注(閾值0.8-1)，獲得分類信息，並在各個分類級別(王國、門、綱、目、科)對每個序列進行計數。每個樣品的群落組成在每個分類級別(王國、門、綱、目、科和屬)進行計數。利用MUSCLE軟件進行快速多序列匹配，得到所有OTUs的係統發育關係。最後以樣本中數據量最少的數據作為均一化的判據，後續的α和β多樣性分析均基於均一化後的數據進行。

統計分析與可視化

我們繪製了一條光曲線來估計樣本當前的測序深度是否可以揭示微生物群落的多樣性[20.］．采用QIME軟件計算α多樣性指數，采用秩和檢驗檢驗α多樣性指數之間的差異[21］．β多樣性分析可以通過UniFrac距離檢測不同組間菌落結構的相似性，采用非度量多維標度(non-metric多維標度，NMDS)方法進行可視化[22，23，24］．采用相似百分比法(SIMPER)量化兩組間差異對每個物種的貢獻[25，26］．UPGMA (Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)是一種比較常用的聚類分析方法;它可以用於研究不同樣本之間的相似性，並對樣本進行聚類分析。此外，利用效應量線性判別分析(LEfSe)篩選組間差異較大的類群，發現生物標誌物[27］．采用QIIME、R軟件包(v3.2.0)、IBM SPSS Statistics (v21.0)進行序列數據分析和數據整理。采用獨立樣本t檢驗和卡方檢驗分別分析連續變量和分類變量之間的統計學差異。三組間連續變量采用單因素方差分析(*P< 0.05)。

病人的特點

所有組都有較高比例的男性參與者，但組間性別差異無統計學意義。血檢中白細胞計數、嗜酸性粒細胞百分比無明顯差異，均在正常範圍內。我們檢測了A1組11例和A2組13例(其餘5例數據缺失)的呼出一氧化氮分數(Fe-NO)和潮汐肺功能，其中A1組潮汐呼氣流量與總呼氣時間之比(TPEF/TE)和峰值呼氣流量與總呼氣流量之比(VPEF/VE)的平均值低於A2組，提示重度阻塞性通氣。然而，兩組之間沒有顯著差異。參與者的一般情況見表1．

細菌豐度和分布

該無pcr文庫使用NovaSeq 6000 (Illumina, USA)進行末端配對測序。通過對reads進行拚接，平均每個樣本測序87349個標簽，質控後獲得81331個有效數據點，質控有效數據點61798個，質控效率為71.37%。將序列聚成符合97%識別閾值的OTUs，共鑒定出6644個OTUs。A組每個樣本識別出182 - 1326個OTUs(平均565)，B組每個樣本識別出282-1334個OTUs(平均580)。

A1組、A2組和B組的豐富度稀疏度曲線表明，所有樣品均具有足夠的測序深度(圖2)。1A)，秩聚類曲線反映樣品分布均勻，物種豐富度高(圖;1B).根據標注結果，為每個樣本或類群選擇門、目、科和屬水平上最豐富的20個物種，生成物種相對豐度的累積條形圖(圖2)。1C)。

肺泡灌洗液標本共檢出11門28綱67目99科165屬，在門水平上可標注為70.64%，在綱水平上可標注為68.68%，在目水平上可標注為64.77%，在科水平上可標注為56.17%，在屬水平上可標注為39.25%。主要的細菌分布是基於相對分類豐度(圖。1D)變形菌門(A1 = 49.1%, A2 = 43.2%, B = 25.5%),厚壁菌門(A1 = 30.9%, A2 = 36.9%, B = 34.9%), Bacteroidota (A1 = 9.1%, A2 = 10.1%, B = 25.9%),和Fusobacteriota (A1 = 0.5%, A2 = 0.4%, B = 5.0%),和在屬級鏈球菌(a1 = 18.8%， a2 = 16.4%， b = 20.1%)Stenotrophomonas(a1 = 9.2%， a2 = 14.9%， b = 0.1%)，普氏菌(a1 = 4.5%， a2 = 1.4%， b = 15.1%)，Sphingomonas(a1 = 13.4%， a2 = 6.5%， b = 0.1%)，葡萄球菌(a1 = 0.8%， a2 = 4.3%， b = 0.1%)，Phyllobacterium(a1 = 11.2%， a2 = 6.3%， b = 0.0%)，奈瑟氏菌屬(a1 = 0.1%， a2 = 0.3%， b = 6.1%)，嗜血杆菌(a1 = 0.5%， a2 = 1.1%， b = 9.6%)，Brevundimonas(a1 = 4.6%， a2 = 3.7%， b = 0.5%)，Porphyromonas(a1 = 0.0%， a2 = 0.0%， b = 3.5%)，梭菌屬(A1 = 0.3%， A2 = 0.01%， B = 4.0%)韋永氏球菌屬(A1 = 1.5%， A2 = 2.9%， B = 6.8%2）.

在門水平上，A1、A2、b組的擬杆菌門(Bacteroidetes)數量低於b組;在門水平上，A1、A2組的變形杆菌門(Proteobacteria)數量高於b組;在屬水平上，細菌門(Bacteroidetes)數量高於b組Sphingomonas而且PhyllobacteriumA1組顯著高於b組PhyllobacteriumA2組高於B組。普氏菌，奈瑟氏菌屬,嗜血杆菌B組明顯多於A1和A2組。

細菌多樣性和菌落結構分析

三組間直接觀察到的OTUs數量無顯著差異(圖2)。2A)， B組α多樣性與A1組和A2組的Simpson多樣性指數差異顯著，且B組的多樣性和均勻度高於A1組和A2組(圖2)。2B).在β-多樣性分析中，我們發現B組細菌群落的Bray-Curtis距離與A1組和A2組不同。A1組與A2組的Bray-Curtis距離差異無統計學意義(圖2)。2C). NMDS圖在A1組和A2組之間距離相似，與B組距離較遠，說明A1組和A2組的菌落結構高度相似，與B組不同(圖2)。2D).關於這方麵的具體信息見附加文件1:附錄1。UniFrac距離各組UPGMA微生物組分類譜聚類結果顯示，對照組與喘息組間差異相對顯著(圖2)。2E)。

微生物群組成的差異

用LEfSe分析組間物種豐度數據，用秩和檢驗檢測組間物種差異，用線性判別分析(LDA)評估組間物種差異的效應大小。繪製了差異種LDA值的分布直方圖和差異種的進化分支。我們發現了47個LDA評分為> 4的生物標誌物，包括嗜血杆菌，奈瑟氏菌屬，普氏菌，Sphingomonadales，Sphingomonas，Delftia,韋永氏球菌屬．

這些差異豐富的類群可以被認為是潛在的生物標誌物(圖。3.一個;(詳見S1)，並在LEfSe圖中按門到屬和類群重要性排序(與類群顏色相似的微生物種群在該組中更重要;無花果。3.B).豐度排名前10位的物種對兩組間變率的貢獻采用SIMPER量化(氣泡大小代表物種的相對豐度，貢獻為物種對兩組間變率的貢獻;無花果。3.C). Anosim’s檢驗顯示B、A1、A2組之間的差異大於組內的差異(表3.）.

人類已經與微生物共生進化，宿主-微生物的相互作用正在逐漸被闡明，人類宿主的細菌定植影響多種疾病[28］．新生兒出生後5分鍾內可在鼻咽和口咽檢測到微生物定殖，表明上呼吸道已開始定殖[29］．最初，新生兒的免疫係統會進行調整，使微生物群能夠順利地在呼吸道定植。穩定的共生菌群會逐步促進新生兒免疫係統的改善，這種菌群的建立使機體具備了對抗致病菌的能力。常駐微生物群和嬰兒的免疫係統在許多方麵受到限製，並受到代謝物和微生物的調節。存在於母乳中的免疫球蛋白A可幫助建立穩定的宿主-微生物群關係[30.］．細菌、病毒和真菌是引起人類呼吸道感染的主要病原體。然而，在30%的呼吸道病例中，常規方法仍未檢測到病原體[31］．

2017年發布的數據表明，支氣管灌洗液和氣管內樣品之間的細菌菌群略有不同[32］．我們對48名兒童的肺泡灌洗液微生物群的分析表明，喘息組的下呼吸道菌群(表現為複發性和持續性喘息)主要由變形菌門組成，其次是厚壁厚壁菌門和擬杆菌門。

而異物組(對照組)患兒肺泡灌洗液標本以厚壁菌門為主，其次為變形菌門和擬杆菌門。兒童下呼吸道菌群的數據相對缺乏，口咽菌群的研究證實，上述門在哮喘和健康人群中均占主導地位[33，34］．一項基於新生兒的研究表明流感嗜血杆菌，複活的,肺炎鏈球菌與出生後5年內的喘息結果有關。雖然沒有直接證據表明這些細菌固定對細胞的影響，但這些關聯可能與嚴重複發性喘息兒童的顯著中性粒細胞升高一致[18，35］．

我們比較了喘鳴組和異物組的微生物屬，觀察到豐富鏈球菌每組sp .;細菌屬的數量Sphingomonas而且Phyllobacterium複發性喘息組明顯高於對照組;Phyllobacterium長時間喘息組明顯高於對照組普氏菌spp。奈瑟氏菌屬spp。,嗜血杆菌對照組的sp值高於喘息組。

低比例的莫拉克斯氏菌屬spp。葡萄球菌spp。,嗜血杆菌喘息組的sp .與增加的sp .的比例不同葡萄球菌spp。莫拉克斯氏菌屬spp。,嗜血杆菌以前曾有報道稱，這些物質會增加兒童患慢性喘息的風險[35，36，37，38，39，40]，並需要進一步調查。高比例的Phyllobacterium尚未報道與嬰兒和兒童的喘息有關。然而，Wen等人發現Phyllobacterium foliaris甲型流感病毒感染兒童口咽微生物;確切的機製尚不清楚[41］．

減少普氏菌在兩組患者中都發現了sp .。普氏菌Spp.是一種常見於粘膜部位的共生固定菌，是主要的呼吸屬[42］．的體內平衡作用普氏菌在健康肺中的作用尚不清楚。吸入脂多糖或脂多糖彈性酶所致小鼠慢性阻塞性肺疾病樣肺的炎症和病理均被該屬減輕，並介導了細胞的生長假單胞菌而且乳酸菌spp。這表明普氏菌(可能是通過創造一個不適合該屬生長的微環境，從而導致其豐度下降)在喘息患者中可能不是病前危險因素。

一些作者比較了普氏菌健康個體肺部與哮喘患者肺部疾病相關杆菌(流感嗜血杆菌B,流感嗜血杆菌,而且複活的）.普氏菌發現其誘導CD83、CD86和CD40激活標記物表麵表達水平相似，但與變形菌門相比，其降低了單核細胞來源的樹突狀細胞中白細胞介素(IL)-12p70、IL-23和IL-10細胞因子的水平。較低的炎症能力普氏菌在老鼠身上也得到了證實，在哪裏普氏菌減少了肺基質細胞巨噬細胞炎症蛋白2-α (IL-8)、腫瘤壞死因子-a (TNF-a)和胸腺基質淋巴生成素的產生，以及肺免疫細胞TNF-a的產生普氏菌肺部可能耐受良好[43，44，45］．

的高比例鏈球菌在所有三組中都發現了sp .，並且已表明其豐度增加莫拉克斯氏菌屬而且鏈球菌患有毛細支氣管炎的嬰兒鼻咽拭子中的細菌與3歲兒童反複喘息有關[46］．這可能表明，嬰兒喘息更可能是由於整體細菌微生態和宿主呼吸和免疫穩態的破壞，而不是單一細菌的影響。下氣道的細菌檢測可能是由於通過微吸入持續暴露於上呼吸道微生物與內皮纖毛清除和呼吸道咳嗽之間的不平衡。

優勢屬差異的確切原因尚不清楚，可能導致長期慢性炎症過程中粘蛋白糖蛋白的分子變化;黏蛋白聚糖是患病氣道中細菌和真菌的重要營養來源和粘附位點，不同的微生物可以利用特定的黏蛋白，影響氣道固定[47］．氣道內的物理和化學因素(包括氧張力、pH值、溫度和粘液)隨著氣道的解剖位置而變化[48]，再加上患有多發性持續性喘息的兒童不規律用藥，可能會導致在免疫失調的情況下建立新的、穩定的、複雜的微生物群。

喘息組的微生物多樣性低於異物組，微生物菌落多樣性降低。細菌引起嬰兒和兒童喘息的確切機製尚不清楚。細菌和宿主之間的免疫平衡可能被破壞。細菌及其產物(如內毒素)可刺激氣道上皮細胞產生細胞因子。一些細胞因子(如核因子kappa B)可以激活IL-8基因，然後啟動正反饋調控，增加中性粒細胞和炎症因子的產生，如IL-8、IL-6和TNF-α。TNF-α產生的增加可增加氣道平滑肌的反應性，從而加重氣道阻塞並引起喘息[49，50，51］．

肺功能檢查有助於判斷以喘息為症狀的疾病的嚴重程度，也有助於評估臨床療效和預後[52］．嬰幼兒最常用的肺功能測試是潮汐呼吸肺功能測試[53］．TPEF/TE和VPEF/VE都是反映阻塞性通氣障礙的重要參數，正常範圍為28-55%。根據梗阻程度，分為輕度梗阻(23-28%)、中度梗阻(15-22%)和重度梗阻(< 15%)[54］．我們觀察到伴有喘息的兒童的肺功能提示重度阻塞性通氣減少。但多重喘息組的平均TPEF/TE和VPEF/VE較持續性喘息組差，我們推測持續性喘息可能是由於某些感染引起的持續氣道痙攣所致，而複發性喘息組肺部損傷更嚴重，可能導致哮喘發生的機會更大。然而，在菌落結構相似的患者中，疾病持續時間為何不同還有待進一步研究。我們推測，這可能與嬰兒或兒童治療不足和無效有關。

本研究的主要優點是匹配的病例對照排除了年齡、時間和性別影響所引起的偏差。我們還闡明了喘息的持續時間可以影響細菌微生物群落的結構。我們采用支氣管鏡下獲得的肺泡灌洗液樣本，更接近正常的下呼吸道微生物菌落組成，以支氣管鏡下異物組為對照，更接近同齡兒童呼吸道細菌群落組成。

然而，我們的研究有一些局限性。我們主要關注微生物的細菌群，不能排除病毒和真菌可能參與兒童反複喘息的可能性。與其他觀察性研究一樣，我們的發現並不一定表明因果關係。16S rRNA測序允許細菌屬和種水平鑒定之間的注釋，但不提供宏基因組技術的分辨率(例如，鳥射測序)，特別是對於密切相關的物種，如鏈球菌種蟲害和普氏菌具體種類可能需要進一步討論。

我們的研究顯示喘息患兒下呼吸道菌群主要為變形菌門，其次為厚壁菌門和擬杆菌門，而健康患兒下呼吸道菌群可能主要為厚壁菌門，其次為變形菌門和擬杆菌門。數量的減少普氏菌在嬰兒和兒童中，SPP可能與反複出現的喘息有關。它可能參與了肺環境內穩態的建立，其機製尚不清楚。在比較持續性喘息患兒和反複喘息患兒下呼吸道細菌菌落結構多樣性時，我們發現兩者在微生物學上可能沒有什麼特別的差異。嬰兒和兒童的喘息更可能是由於整體細菌微生態和宿主呼吸免疫平衡的破壞，而不是單一細菌的影響。

總的來說，我們的研究結果表明，微生物群的診斷方法應該進一步完善，與動物模型相關的縱向研究，如反複喘息兒童肺泡灌洗液的整體固定，可以進一步完善，以探索微生物定殖在兒童喘息中的作用。還需要進一步的研究來證實總體微生物定殖的改變是否可以逆轉嬰幼兒反複喘息的臨床症狀。

本研究中產生或分析的所有數據均包含在本文及其補充文件中。

背景:

脫氧核糖核酸

Fe-NO:

分數呼出一氧化氮

高分子聚合物:

人類微生物組計劃

IL:

白介素

LDA:

線性判別分析

LEfSe:

效應量的線性判別分析

nmd:

非度量多維標度

OTU:

操作分類單位

核糖體rna:

核糖體核糖核酸

TNF-a:

腫瘤壞死因子-

TPEF / TE:

潮汐呼氣流量與總呼氣時間之比

VPEF / VE:

呼氣流量峰值與總呼氣流量之比

沒有一個

本工作由國家衛生計生委四川省基金項目(No. 16PJ067)資助。

作者及隸屬關係

1. 四川省成都市慶陽區日月大道1617號電子科技大學醫學院，成都市婦幼中心醫院兒科肺科，郵編610091

   姚佳偉，艾濤，夏萬民，範英紅，謝誠，張磊

貢獻

LZ和TA構思並設計了該研究。WX和JY收集數據。JY和TA對數據進行分析。LZ進行實驗室分析。JY寫了這篇論文。TA、YF、CX對論文進行了批判性的修改。所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。

相應的作者

對應到Lei張．

倫理批準並同意參與

我們確認所有方法都是按照1964年《赫爾辛基宣言》及其後來的修正案或可比的道德標準進行的。我們確認已從所有參與者的父母和/或法定監護人處獲得書麵知情同意。本研究由成都市婦女兒童中心醫院倫理委員會批準(民族審定號2016 [22])。

發表同意書

不適用。

相互競爭的利益

作者宣稱他們之間沒有利益衝突。

出版商的注意

beplay外围下载施普林格自然對出版的地圖和機構從屬關係中的管轄權主張保持中立。

開放獲取本文遵循知識共享署名4.0國際許可協議，允許以任何媒介或格式使用、分享、改編、分發和複製，隻要您對原作者和來源給予適當的署名，提供知識共享許可協議的鏈接，並注明是否有更改。本文中的圖像或其他第三方材料包含在文章的創作共用許可協議中，除非在材料的信用額度中另有說明。如果材料未包含在文章的創作共用許可協議中，並且您的預期使用不被法定法規所允許或超出了允許的使用範圍，您將需要直接獲得版權所有者的許可。如欲查看本牌照的副本，請瀏覽http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．創作共用公共領域奉獻棄權書(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)適用於本條所提供的資料，除非在資料的信用額度中另有說明。

轉載及權限