ebv相關疾病兒童腺苷脫氨酶的多樣性

背景

腺苷脫氨酶(ADA)是一種參與嘌呤代謝的酶，在細胞免疫中具有重要作用。因此，本研究探討了ADA與eb病毒(EBV)相關疾病的關係。

方法

我們回顧性收集了2018年5月1日至2019年3月31日期間在蘇州蘇州大學兒童醫院住院的所有兒童的數據，他們接受了血漿EBV-DNA聚合酶鏈反應、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和ADA檢測。

結果

在6868名兒童中，1877名兒童的ADA水平升高，4991名兒童的ADA水平在正常範圍內。多因素logistic回歸分析顯示，ALT(調整比值比值比值[aOR] = 1.001, 95%置信區間[CI]: 1.001 ~ 1.002)、EBV感染(aOR = 8.486, 95% CI: 6.753 ~ 10.663)、炎症性疾病(aOR = 3.915, 95% CI: 3.198 ~ 4.794)、自身免疫性疾病(aOR = 2.307, 95% CI: 1.823 ~ 2.920)、惡性疾病(aOR = 1.381;95% CI: 1.101-1.734)是ADA水平升高的危險因素。此外，EBV相關疾病的ADA水平存在顯著差異，包括傳染性單核細胞增多症、非典型EBV感染、呼吸道感染、惡性疾病和其他疾病(P< 0.05)。此外，ADA水平與eb病毒載量呈正相關(r = 0.501，P< 0.05)。

結論

這項大型回顧性研究發現了ADA與ebv相關疾病之間的相關性，這可能有助於臨床醫生根據血漿ADA濃度及早發現這些疾病。

腺苷脫氨酶(ADA)是一種與嘌呤代謝和免疫功能密切相關的多功能蛋白。先前的研究證實了ADA在淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞的生長和分化中起關鍵作用;它也是T淋巴細胞介導的細胞免疫的標誌[1］．此外，ADA與炎症、自身免疫性疾病、獲得性免疫缺陷綜合征、腫瘤密切相關，其濃度與疾病嚴重程度呈正相關[2,3.,4］．大量研究表明，在乙肝、丙肝和自身免疫性肝炎中，肝細胞的損傷、壞死和膜通透性增加會增加血清ADA活性[5］．Mejer等人[6]還發現，在一項小樣本研究中，傳染性單核細胞增多症(IM)患者的ADA水平升高，但ADA水平與其他eb病毒(EBV)相關疾病之間的關係未被描述。

EBV是一種伽馬皰疹病毒，感染全球至少95%的成年人[7］．在發展中國家，EBV接觸主要發生在5歲左右的兒童中。在發達國家，感染發病延遲，但成年人幾乎都呈陽性[8］．年幼兒童的大多數感染是良性的，通常是亞臨床感染[7］．EBV感染最常見的急性表現為發熱性病毒性上呼吸道疾病[7]，年輕人更有可能出現IM [9］．然而，一些感染EBV的兒童發展為噬血細胞綜合征或進展為慢性活動性EBV感染。此外，EBV與自身免疫和腫瘤相關[10,11］．EBV感染還可以激活細胞毒性t淋巴細胞(ctl)和自然殺傷細胞，激活的ctl引起細胞介導的免疫反應，導致原發性感染的臨床表現[11］．

ADA在ebv介導的免疫應答中的作用尚不清楚。因此，本研究研究了異常高的血漿ADA濃度的危險因素，比較了EBV相關疾病的血漿ADA濃度，探討了ADA水平與EBV病毒載量的相關性。我們的目的是確定使用ADA作為EBV感染的診斷或疾病嚴重程度標記的可行性。

數據來源和研究設計

我們於2018年5月1日至2019年3月31日在中國東南部蘇州的一家三級保健醫院(蘇州大學兒童醫院)進行了一項回顧性、觀察性研究。我們納入了所有進行血漿EB核酸、ebv特異性抗體和肝功能測定的住院患者。我們收集了患者人口統計數據、血漿EBV DNA、EBV特異性抗體、入院時穀丙轉氨酶(ALT)和ADA水平以及診斷信息(基於出院診斷)。

我們招募了6868名年齡在0 - 16歲之間的患者(4033名男孩，2835名女孩)，將患者分為< 1歲組(I組)、1 - < 3歲組(II組)、3 - < 6歲組(III組)和6歲組(IV組)。本研究遵循《赫爾辛基宣言》的倫理原則，並獲得東蘇州大學兒童醫院倫理委員會(No.2019KS004)批準。

IM和非典型EBV感染定義

EBV-IM的診斷標準如下[12:(1)至少有以下三種臨床表現:發熱、扁桃體咽炎、頸淋巴結病、肝腫大、脾腫大;(2)對EBV病毒衣殼抗原(VCA-IgM)陽性的免疫球蛋白(Ig) M和IgG，對核抗原(EBNA)陰性或VCA-IgM陰性和vca -IgG陽性(低親和力)的IgG;(3)排除其他感染，如巨細胞病毒和人體免疫缺陷病毒。本研究將非典型EBV感染定義為發熱或外周血中非典型淋巴細胞升高，且無靶器官損傷[13］．

實驗室檢測

血漿EBV-DNA聚合酶鏈反應(PCR)

取入院患者外周血，立即離心檢查。首先，將10 μL血漿與10 μL DNA提取液(中國湖南盛翔生物科技有限公司)混合。加入40 μL PCR混合液，2000 rpm離心30 s。實時定量PCR在LightCycler 480II儀器(Roche, Basel, Switzerland)上進行，條件為:50°C持續2分鍾，然後94°C持續2分鍾，94°C持續5秒，57°C持續30秒，25°C持續10秒，45個循環。臨界，陰性，陽性，四個陽性對照(10，410日,510日,6和10⁷副本/mL，分別)。反應結束後，通過比較樣品的循環閾值(Ct)與標準曲線，計算病毒DNA載量。EBV陰性定義為陰性對照的Ct值，EBV陽性定義為Ct值≤39 (DNA拷貝數> 400 copies/mL)。

間接免疫熒光檢測ebv特異性抗體

采用抗EBV-VCA IgG/IgM、抗ebv -早期抗原(EA) IgG和抗EBNA IgG間接免疫熒光(IIF)試劑盒(Euroimmun, Lübeck，德國)測定血清EBV-VCA、EA和EBNA水平。所有步驟都是按照製造商的說明執行的。通過比較尿素處理和未處理兒童血清的熒光強度來確定抗體親和力。熒光強度差異≥2為低親和力，差異< 2為高親和力。

ADA和ALT

采集入院患者的外周血。分別使用乳酸脫氫酶測定試劑盒(北京強生物技術有限公司，北京，中國)和過氧化物酶測定試劑盒(美康生物技術有限公司，上海，中國)測定血清ALT和ADA水平。使用日立7180生物醫學分析儀(日立高科技公司，東京，日本)檢測這兩種藥物。ALT和ADA的正常值(參考值)分別< 40 U/L和< 25 U/L。

統計分析

數據以數字(百分比)或中位數(四分位範圍)的形式表示。所有統計分析均使用IBM SPSS Statistics for Windows版本25 (IBM公司，Armonk, NY, USA)進行。Wilcoxon和Kruskal-Wallis檢驗用於具有傾斜分布的連續變量。分類變量分析采用卡方檢驗。采用單因素和多因素logistic回歸分析確定95%置信區間(ci)的比值比(ORs)。采用Spearman相關分析確定離散變量之間的相關性。統計顯著性設定為P< 0.05。

病人的特點

我們納入了6868例進行血漿EBV-DNA、ALT和ADA檢測的住院患者。平均年齡4.3(±3.0)歲，男女比例為1:4。血漿EBV DNA陽性率為7.0% (483/6868);1877例(27.3%)和1667例(24.3%)患兒ADA和ALT水平升高。

根據出院診斷，住院患者分為四類:炎性疾病(n= 3030)、自身免疫性疾病(n= 1006)，惡性疾病(n= 1061)和其他疾病(n= 1065)。其他疾病包括貧血、血友病、黃疸、胃腸道畸形、遺傳性代謝疾病、免疫缺陷疾病、麵癱、癲癇、皮疹、心肌病和先天性心髒病。

基於ADA級別的一般特征

總的來說，4991名患者ADA水平正常，1877名患者ADA水平升高。ADA正常組與ADA升高組的性別、年齡、ALT水平、血漿EBV DNA陽性率、疾病類別差異有統計學意義(p < 0.05)。P< 0.05;表格1)．ADA水平升高在女孩、< 3歲、炎症性疾病、穀丙轉氨酶高、EBV陽性患者中最為常見。

ADA升高的危險因素

單因素回歸分析確定了ADA水平和ALT水平升高、EBV感染和疾病類別之間的關聯(表2)．此外，調整性別和年齡的多因素回歸分析顯示，ALT水平(調整後的OR [aOR] = 1.001, 95% CI: 1.001 ~ 1.002)、EBV感染(aOR = 8.486, 95% CI: 6.753 ~ 10.663)、炎症性疾病(aOR = 3.915, 95% CI: 3.198 ~ 4.794)、自身免疫性疾病(aOR = 2.307, 95% CI: 1.823 ~ 2.920)和惡性疾病(aOR = 1.381, 95% CI: 1.101 ~ 1.734)是ADA水平升高的危險因素;其中，EBV感染是最強的危險因素。

ebv相關疾病的ADA水平

根據出院診斷，483名兒童血漿EBV陽性，並被診斷為呼吸道感染、IM、非典型EBV感染、惡性疾病(如噬血細胞淋巴組織細胞增多症和腫瘤)和其他疾病。其他疾病包括川崎病、特發性血小板減少性紫癜、癲癇、口炎和腦膜炎。此外，279名兒童ALT水平正常，204名兒童ALT水平升高。

在ALT水平正常的兒童中，患有IM(97.3%)和非典型EBV感染(91.7%)的兒童ADA水平明顯高於患有呼吸道感染(45.8%)、惡性疾病(57.1%)或其他疾病(51.4%)的兒童(P< 0.05;表格3.和無花果。1)．此外，在IM和非典型EBV感染組中，ADA濃度明顯高於其他三組(P< 0.05)。

最後，ALT水平升高組的IM、非典型EBV感染和呼吸道感染患者的ADA水平高於ALT水平正常組(圖1)。2)．

ALT正常兒童ADA水平與EB病毒載量的相關性

IM組EB病毒載量明顯高於非典型EBV感染、呼吸道感染、惡性疾病和其他疾病組(圖1)。3.)．Spearman相關分析顯示EB病毒載量與ADA水平呈正相關(r = 0.501，P< 0.05;無花果。4)．

ADA是一種參與嘌呤代謝的酶，在細胞免疫中具有重要作用。此外，它主要位於淋巴組織中，並參與細胞免疫反應[14］．然而，ADA也存在於肝細胞中，當肝細胞受損時，外周血中ADA水平升高[15］．例如，ADA水平在結核分枝杆菌感染、自身免疫性疾病、肝炎和惡性腫瘤[2,3.,4,16］．因此，在炎症過程中，ADA的表達和活性顯著增加，單核細胞和巨噬細胞是細胞外ADA的重要來源[17］．ADA與二肽基肽酶-4 (CD26)結合，在分化簇(cd4)中表達⁺T淋巴細胞輔助性細胞與記憶T細胞形成複合物[18］．這種複合物通過降低局部腺苷濃度來減輕對T淋巴細胞增殖和激活的抑製作用。促進幼稚T細胞向輔助性和記憶性T細胞分化，增加CD4的產生⁺CD25⁺，叉頭箱P3(即Foxp3)⁺調節性T細胞。在樹突狀細胞和CD4+ T細胞之間的免疫突觸上，CD26-ADA複合體作為共刺激劑，誘導白細胞介素-6的產生，增加幹擾素-γ和腫瘤壞死因子-α的分泌，增強炎症反應[19,20.］．這些事件表明ADA在t淋巴細胞免疫中起著重要作用。在本研究中，我們以非炎症性疾病、先天性疾病和代謝性疾病為參考，發現ADA水平升高在炎症性疾病中最常見，其次是自身免疫性疾病和惡性疾病。然而，EBV感染也與ADA水平密切相關。

EBV感染激活細胞毒性T細胞介導的免疫反應，與各種疾病密切相關，如呼吸道感染、IM、噬血細胞淋巴組織細胞增多症、惡性腫瘤等[11］．此外，EBV感染的多樣性與免疫功能密切相關[8］．在EBV- dna陽性的兒童中，有90%以上的IM和非典型EBV感染患兒ADA水平升高，提示在單獨的ADA特異性較低的情況下，ADA水平對診斷EBV-IM和非典型EBV感染具有高度敏感性。相比之下，隻有一半患有EBV相關呼吸道感染和惡性疾病的兒童ADA水平升高，這可能是因為EBV感染可能不是疾病的主要原因，或者EBV感染沒有引起強烈的免疫反應[8,21］．

血漿中的EBV DNA表明EBV感染活躍[22］．在排除ALT的影響後，我們發現IM患者血漿EBV負荷和ADA水平較高，且ADA水平與EBV負荷呈正相關。這些結果表明，ADA與EBV感染和溶性EBV感染的免疫應答有關。先前的體內研究確定，EBV編碼RNA 2 (EBER-2)是一種小型的非翻譯轉錄本，在建立潛伏感染時有助於保護EBV免受抗病毒作用[23］．其機製涉及到EBER-2與人類ADA信使RNA之間的三個互補區域，導致ADA翻譯被抑製[24］．ADA可以去除多餘的細胞外腺苷(一種成熟的單核細胞、細胞毒性T淋巴細胞和中性粒細胞抑製劑)[25］．因此，高水平的分泌腺苷導致對ebv感染細胞的免疫反應下調，可能促進潛伏感染。我們假設這就是為什麼我們的研究沒有發現ebv相關惡性腫瘤中ADA水平顯著升高的原因。在產生ebv的細胞係B95-8和P3HR-1中也檢測到相對較低的ADA水平[26］．

一些研究表明，血漿EBV拷貝數可能是EBV相關疾病的疾病嚴重程度和預後生物標誌物[27］．例如，陳等人。[28]發現繼發性噬血細胞性淋巴組織細胞增多症患者血清ADA水平升高。但在本研究中，在ebv相關惡性疾病患者中，ADA水平正常，這可能與ADA參與代謝和免疫信號通路有關。

這項研究有一定的局限性。首先，這是一項回顧性研究。其次，需要進一步開展ADA在EBV感染相關疾病中的作用機製的前瞻性工作。

這項大型回顧性研究首次探索了ADA、ebv相關疾病和EB病毒載量之間的相關性，發現了ebv相關疾病之間ADA水平的差異，以及ADA水平與EB病毒載量之間的正相關;這些結果可能有助於臨床醫生根據血漿ADA濃度及早發現這些疾病。根據以往文獻報道，ADA在EBV相關疾病中表現出的多樣性可能與其參與t淋巴細胞介導的免疫應答、EBV在感染細胞中的免疫逃逸以及肝細胞破壞有關。這將為進一步探索ADA在ebv相關疾病中的作用機製提供新的思路。

支持本研究結果的數據可根據合理要求從通訊作者處獲得(2231365607 @qq.com)．

艾達:

腺苷脫氨酶

EBV:

巴爾病毒

ALT:

丙氨酸轉氨酶

或者:

優勢比

置信區間:

置信區間

即時通訊:

傳染性單核細胞增多

細胞毒性t淋巴細胞:

細胞毒性t淋巴球

VCA:

病毒衣殼抗原

拿拿淋:

核抗原

巨細胞病毒:

巨細胞病毒

艾滋病毒:

人類免疫缺陷病毒

感謝東吳大學兒童醫院實驗室提供肝功能和血漿EBV-DNA檢測分析數據。

本研究得到蘇州市科技計劃項目(SKJY2021106)的資助。

作者指出

1. 廷詩和禹申對這項工作貢獻相同。

作者和聯係

1. 江蘇省蘇州市景德路303號，蘇州大學附屬兒童醫院傳染病科

   史婷，張偉，錢美英，陳秀麗，黃琳琳，田建梅

2. 江蘇省臨床免疫學研究所，蘇州大學第一附屬醫院，蘇州

   昱

貢獻

TS、LH和JT對研究進行了概念化和設計。TS、YS、WZ、XC和MQ設計了數據采集儀器並采集數據。TS和LH負責數據的分析和解釋。TS, YS和LH起草了手稿。JT、YS、TS、WZ、XC和MQ對手稿進行了關鍵性的修訂，並在各自的專業領域做出了重大貢獻。所有作者同意提交的最終稿件，並同意對所有方麵的工作負責。

相應的作者

對應到靈靈黃或堅美田。

倫理批準和同意參與

本研究獲得中國蘇州大學兒童醫院倫理委員會(No.2019KS004)批準。所有方法都是根據1964年《赫爾辛基宣言》及其後來的修正案或類似的道德標準進行的。由於該研究的回顧性性質，參與同意書被放棄。

同意出版

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

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