鈉電壓門控通道的多態性，α亞基1(SCN1A -A3184G)非損傷性癲癇兒童的基因:一項病例對照研究

背景

神經元鈉電壓門控通道的突變，α亞基1 (SCN1A)基因與癲癇有關。我們調查了SCN1A-A3184G埃及非損傷性癲癇兒童和青少年的多態性。

方法

在埃及曼索拉大學兒童醫院進行了一項前瞻性病例對照觀察研究，包括326例非損傷性癲癇患兒(163例抗癲癇藥物(AEDs)耐藥病例和163例抗癲癇藥物應答者)和163例健康對照。采用一步實時聚合酶鏈反應(PCR)進行分子分析。統計分析采用學生t檢驗、Monto Carlo檢驗、卡方檢驗和Mann-Whitney檢驗。

結果

所有研究參與者的年齡、性別和體重都是匹配的(p= 0.07, 0.347, 0.462)。他們有(AA)和(AG)基因型，但沒有(GG)變異。(AG)和(AA)基因型及A-和g -等位基因在病例和對照組之間無顯著差異(p= 0.09和0.3)。在研究的基因型和等位基因方麵，我們沒有發現AEDs應答者和耐藥病例之間有顯著差異(p= 0.61和0.746)。在抗藥組中，我們觀察到(AG)基因型和發作頻率之間的顯著關聯(p= 0.05)，強直陣攣發作(p< 0.001)，首次癲癇發作年齡較輕(p= 0.03)、異常腦電圖(EEG) (p< 0.001)，癲癇家族史陽性(p= 0.006)、托吡酯(p= 0.03)和丙戊酸(p< 0.001)，而(AA)基因型與卡馬西平(p= 0.03)。而在AEDs反應者中，AG基因型與異常腦電圖活動、左乙拉西坦和卡馬西平(p= 0.016, 0.028和0.02)。

結論

的SCN1A-A3184G基因型和等位基因與埃及兒童的癲癇風險無關。據報道，AG基因型與難治性癲癇的一些預測因子之間存在顯著的相關性。

癲癇是一種獲得性和遺傳因素均參與的多因子通道病[1］．了解癲癇的確切病因對患者的治療和神經生物學研究至關重要，這些研究可能指導未來的個性化治療[2］．神經元電壓門控鈉通道(SCN)是負責神經元內動作電位產生和傳播的蛋白質。這是通過膜通透性對鈉離子的影響和離子沿電化學梯度向下擴散的促進作用而發生的，直到鈉平衡電位[3.］．

有證據表明視交叉上核癲癇發病機製中的多態性。這些多態性與一係列癲癇綜合征相關，如伴發熱性癲癇發作的廣泛性癲癇、嬰幼兒邊緣性嚴重肌陣攣性癲癇、Dravet綜合征、Doose綜合征和嬰兒痙攣[4，5］．大部分的視交叉上核突變是在SCN1A吉恩和更少的人在SCN2A，SCN8A而且SCN1B基因(6］．的SCN1A該基因位於2號染色體(2q24.3)上，包含26個外顯子。SCN1A編碼鈉通道NaV1.1的α亞基[7］．這種通道將鈉離子通過細胞膜上的小孔。其體係結構包括四個領域和六個部分;4個同源結構域(D1-D4)，每個結構域包含6個α-螺旋節段(S1-S6)。每個結構域的S4段或電壓感應螺旋上的帶正電荷的殘基參與了膜電位的漸變變化和動作電位的產生[8］．

一些研究已經報道了鈉通道阻滯劑治療由遺傳通道病引起的癲癇的療效。卡馬西平、奧卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、拉科沙胺和利多卡因通過阻斷動作電位傳播過程中鈉離子通過鈉離子通道的運動來預防癲癇活動。由於結構相似，這組抗癲癇藥物(aed)通過作用於鉀通道具有額外的優勢，從而控製由電壓門控鉀通道基因突變引起的遺傳性癲癇[9］．

的SCN1A-A3184G (p.Thr1067Ala)多態被認為與鈉通道的門控有關，因此使它們對鈉通道阻滯劑不敏感[10，11］．協會SCN1A-A3184G在幾個非白種人人群中研究了多態性與癲癇風險的關係[12，13，14，15]以及在有限數量的白種人中[10，16的結果不一致，因此需要進行額外的研究。

一些研究報告了SCN1A基因多態性與AEDs抗性[8］．其他人試圖調查這些多態性與aed選擇和劑量之間的可能聯係。Tate等人報道了SCN1A多態性與苯妥英和卡馬西平劑量的關係，並提示根據基因型，最大所需劑量有降低的趨勢[17］．Heinzen等人注意到AA基因型的個體rs3812718變異比GG基因型的人需要更高劑量的AEDs [18］．

在目前的研究中，我們調查的模式和頻率SCN1A-A3184G (p.Thr1067Ala)埃及非損傷性癲癇兒童和青少年的多態性，包括AEDs反應者和耐藥病例。我們測試了SCN1A-A3184G難治性癲癇的基因型和一些預測因子。我們還通過描述常用的aed及其與基因型的可能聯係，強調了研究目標多態性可能的藥理學意義。

研究設計和參與者

我們於2020年2月至2022年1月在埃及曼蘇拉大學兒童醫院進行了一項初步前瞻性病例對照研究。我們招募了326名非損傷性癲癇患兒;163名AEDs耐藥患者和163名AEDs應答者。我們選取了163名性別和年齡相近的健康兒童作為對照組。我們從同一家醫院招募了對照組，讓他們進行定期隨訪，或檢查咽炎和輕度腸胃炎等輕微疾病。所有對照組均無神經障礙史，且與患者屬於同一種族。

如果患者有至少兩次無端癲癇發作並伴有癲癇樣腦電圖(EEG)改變的病史，且神經檢查和發育正常，且磁共振成像未檢測到結構性病變，則可描述為非損傷性癲癇[19］．如果在使用三種適當的最大耐受劑量aed後1年內至少發生4次癲癇發作，則定義aed耐藥[20.，21］．在開始使用ads後，從發作中恢複至少1年是考慮兒童為ads反應者的標誌[20.，22］．排除單次癲癇發作、代謝紊亂、繼發性癲癇和治療依從性差的患者。

臨床資料收集

我們從檔案中檢索患者的相關數據，包括他們的性別、年齡、癲癇發作的類型和頻率、癲癇發作的起始年齡、上一次癲癇發作的持續時間(以月為單位)、腦電圖檢查結果和AEDs治療。我們使用2017年國際抗癲癇聯盟(ILAE)的手術分類評估了所有患者的癲癇發作類型(強直、強直-陣攣、陣攣、肌陣攣和無發作)[19］．

SCN1A (rs2298771)多態性分子分析

我們使用QIAamp DNA血液迷你試劑盒(由QIAGEN, USA提供，目錄編號:51104)從全靜脈血中提取基因組DNA，並保存在−20°C直到使用。我們使用NanoDrop™2000分光光度計(Thermo Scientific, Waltham, MA)測量了對照組和病例的基因組DNA純度和濃度。

基因分型SCN1A (rs2298771)通過TaqMan單核苷酸多態性(SNP)基因分型分析(Applied Biosystem, Foster City, CA)進行多態性分析。PCR引物和變異型等位基因特異性TaqMan MGB探針由Applied Biosystem公司設計。SNP ID為C 11748767_20SCN1A (rs2298771)多態性;染色體定位為chr2:166036278。

上下文序列[VIC / FAM]為:TAGTCAAGATCTTTCCCAATTTCTG[C/T]TGTATGATTGGACATACAACTGTCT。

作為TaqMan MGB探針50端的報告子，VIC和FAM分別用於a -等位基因(Allele-1)和g -等位基因(Allele-2)。

我們製備了25 μL的PCR反應液用於qPCR分析:7.25 μL無dnase和rnase水，12.5 μL TaqMan通用主混合物II與UNG 2× (# 4440042, Applied Biosystem)， 4 μL DNA模板和1.25 μL TaqMan試劑20×。我們將PCR反應混合物轉移到48孔反應板上，用適當的蓋子密封。然後離心，然後加載到第一步實時PCR (Applied Biosystem)。反應的循環階段如下:第一階段為UNG在60°C孵育30 s，第二階段為聚合酶激活，在95°C孵育10 min，第三階段為PCR，包括在95°C變性15 s, 60°C退火/延伸60 s，最後第四階段在60°C孵育30 s。我們通過評估端點的熒光強度來區分等位基因。

我們使用SDS軟件1.7版(Applied Biosystem)對測量結果進行分析，並檢測基因型(圖5)。1而且2)．我們隨機抽取10%的原始標本進行重複分析，以排除基因分型的錯誤。我們沒有檢測到基因型之間的差異，這是確定的副本。

統計分析

我們使用社會科學統計包(SPSS)版本25 (IBM公司，阿蒙克，紐約州)分析數據。數量(百分比)比較采用Monto Carlo檢驗和χ 2檢驗²)．參數資料(均數±標準差)采用Student’s t檢驗，非參數資料(中位數和四分位差)采用Mann-Whitney檢驗。P≤0.05為有統計學意義。基因型和等位基因頻率SCN1A (rs2298771)多態用卡方檢驗驗證與Hardy-Weinberg平衡(p> 0.05)。

研究參與者的描述性數據和特征

AEDs耐藥組和AEDs應答組均與對照組在年齡、性別和體重(p= 0.07, 0.347, 0.462，表1)．耐藥組癲癇發作頻率高，距離上一次發作間隔時間短，腦電圖異常多(p< 0.001、表2)．AEDs反應者和抗藥組在首次發作年齡方麵無統計學差異(p= 0.642,表2)．在癲癇發作類型方麵，兩組中最常見的癲癇發作類型為強直陣攣型，在AEDs應答組和AEDs耐藥組中分別為63.8%和76.1%。AEDs反應組的其他常見類型是強直性癲癇發作(20.9%)和失神性癲癇發作(9.2%)，而在AED耐藥組，失神性癲癇發作占10.4%，肌陣攣性癲癇發作占7.4%(表2)2)．

患者抗癲癇藥物使用情況

在本研究中，丙戊酸是所有組中使用頻率最高的ads (ads應答組的82.2%和ads耐藥組的90.2%)，其次是ads耐藥組的左乙拉西坦(41.7%)和ads應答組的卡馬西平(27%)。兩組在aed使用方麵有統計學上的顯著差異。卡馬西平在aaed反應組中使用更頻繁(p= 0.03)，而左乙拉西坦在aed耐藥組中使用頻率更高(p= 0.003)。托吡酯僅用於AEDs耐藥組2)．

SCN1A-A3184G基因型及等位基因在研究組間的分布

AG基因型SCN1A-A3184G多態性是所有組的主要基因型(對照組、AEDs應答組和AEDs耐藥組分別為81.6、76.1和73.6%，見表3.)．研究人群中描述了No (GG)基因型。(AG)和(AA)基因型及A-和g -等位基因在病例和對照組之間無顯著差異(p= 0.09和0.3)。

AEDs反應組、AEDs耐藥組和對照組在基因型和等位基因方麵無顯著差異SCN1A-A3184G多態性(p基因型= 0.214，等位基因= 0.563，見表3.)．此外，我們沒有發現AEDs應答者和耐藥患者在目標基因型和等位基因方麵的顯著差異(p= 0.61, 0.746，表3.)．

SCN1A-A3184G基因型與患者特征的相關性

關於聯合AEDs反應者和耐藥病例，表4在ag基因型病例中，癲癇發作頻率更高，廣泛性癲癇樣腦電圖活動更多(p= 0.004和< 0.001)。與AG基因型相關的頻繁發作類型為強直陣攣、強直和失神發作，而與AA基因型相關的頻繁發作類型為強直陣攣和強直發作。除托吡酯僅用於AG基因型病例外，AG和AA基因型對aed無顯著差異。

在AEDs耐藥病例中，AG基因型與發病年齡早、癲癇發作頻率、腦電圖異常、癲癇家族史、托吡酯和丙戊酸陽性有顯著相關性(p < 0.05)。p= 0.03, 0.05， < 0.001, 0.006, 0.03和< 0.001，表4)．而在AEDs反應者中，AG基因型與異常腦電圖活動、左乙拉西坦和卡馬西平(p分別= 0.016,0.028和0.024)．

癲癇是一種高度異質性的疾病，具有確定的遺傳背景[23，24］．超過四分之一的癲癇相關基因編碼離子通道蛋白，包括配體門控離子通道(如-氨基丁酸受體、n -甲基- d-天冬氨酸受體和尼古丁乙酰膽堿受體)和電壓門控離子通道(如鈣通道)^{2 +}K⁺和鈉⁺渠道)[25］．第一個SCN1A到2000年，癲癇患者中發現基因突變[23，但現在有許多新的SCN1A突變已被確認，使其成為最常見的癲癇相關基因[26］．在我們的初步研究中，我們調查了的模式和頻率SCN1A-A3184G埃及兒童和青少年非損傷性癲癇的等位基因和基因型。我們發現AG基因型和A等位基因是研究參與者的主要模型。

在目前的研究中，我們報道了癲癇患者和對照組之間的無顯著差異SCN1A-A3184G基因型和等位基因。AEDs應答者與耐藥患者在這些基因型和等位基因方麵無顯著差異。在我們的埃及患者中缺乏顯著的差異可以用種族差異來解釋。Baum等人在他們的大型多民族研究中證實了這一點，他們認為SCN1A-A3184G (rs2298771)多態性是症狀性癲癇患者中顯著的種族相關位點(p< 0.001)，而另一項研究的頻率SCN1A位點(rs10188577和rs3812718)沒有因種族而異[15］．然而，相對較小的樣本量可能是解釋我們的結果的一個限製因素。

我們的結果也與Chou等人報道的83名對照受試者與104名台灣癲癇兒童在有關方麵的差異不顯著SCN1A-A3184G基因型及等位基因[14］．我們也同意Kang等人的觀點，他們調查了311名兒童SCN1A-A3184G (rs2298771)而且SCN2A-G56A (rs17183814)並測試它們與難治性癲癇的關係。他們報告了對照組和病例之間不顯著的差異SCN1A-A3184G多態性，但A等位基因的SCN2A-G56A多態性與難治性癲癇發作有關[27］．此外，德國的一項研究也描述了類似的發現SCN1A-A3184G多態性未被認為是特發性廣泛性癲癇的主要誘因[28］．我們也同意Hosseini等人評估的頻率SCN1A (rs2298771 & 7,601,520)和ABCB1 (rs1045642)伊朗特發性難治性癲癇人群的多態性。他們招募了81名健康受試者和34名特發性難治性癲癇患者，研究組間差異不顯著[29］．另一項包括471名癲癇患者(272名aed有反應，199名aed有耐藥性)的中國研究也與上述結果一致。作者研究了aed反應性與SCN1A，SCN2A,SCN3A多態性，並與神經元鈉通道的mRNA表達相關。他們提出了一種聯係Scn2a ivs7-32a > g和AEDs反應，沒有任何證據表明對mRNA表達或剪接有影響。然而，他們報告說SCN1A-A3184G多態性與抗aaed [30.］．

另一方麵，Lakhan等人認為SCN1A-A3184G多態性在北印度癲癇患者中更為常見[p= 0.005;95%置信區間= 1.19-2.61，優勢比= 1.76][12］．在Li等人所做的元分析研究中SCN1A-A3184G (rs2298771)多態性與AEDs反應顯著相關[31］．

在目前的研究中，我們沒有發現的GG基因型SCN1A-A3184G研究人群的多態性。這與斯洛文尼亞的一項研究相反，在該研究中，G等位基因與癲癇患者中較低的癲癇風險和較高的緩解率有關[7］．這些差異主要可以用種族間差異來解釋SCN1A等位基因和基因型分布(20.］．

有趣的是，目前的研究表明雜合子AG基因型在癲癇發作頻率較高的癲癇病例中與廣泛性癲癇樣腦電圖活動有顯著的相關性。ag基因型難治性癲癇患者與癲癇發作的早期年齡和上一次發作後持續時間之間可能存在關聯。在回顧文獻時，沒有以前的報告檢驗兩者之間的聯係SCN1A-A3184G (rs2298771)多態性與難治性癲癇的預測因子。我們想要強調的是，在之前的研究中，更高的癲癇發作頻率、廣泛性癲癇樣腦電圖活動和更早的癲癇發作發作年齡被證明是AEDs反應的重要預測因素[32，33］．這一觀察結果為進一步研究黃曲黴的AG基因型打開了大門SCN1A-A3184G多態性作為治療反應的預測因子，有助於根據癲癇兒童基因型設計個性化藥物[34］．然而，還需要大規模的多中心研究來證明這種關聯。

為了在不同類型的癲癇中選擇最合適的aed，開展了幾項研究[9，35］．目前的研究表明，在ag基因型應答者中，左乙拉西坦和卡馬西平的使用頻率高於AA基因型應答者。AEDs耐藥組中，AG基因型患兒多使用托吡酯和丙戊酸，AA基因型患兒多使用卡馬西平。這一觀察突出了SCN1A-A3184G基因型在選擇合適的aed中的作用。

回顧文獻，進行了一些研究，以檢測可能的藥理影響SCN1A-A3184G癲癇治療中的多態性。最近的一項薈萃分析包括八項研究報告了亞洲癲癇患者和GG基因型SCN1A-A3184G多態性患者卡馬西平耐藥風險較高[36］．另一方麵，另一項包括18項研究(2546例患者)的meta分析報告稱，相同的多態性與卡馬西平耐藥之間沒有關聯[37］．關於丙戊酸，一項中國研究表明SCN1A-A3184G多態性對藥物反應無影響[38］．事實上，收集來自不同民族的數據擴展了對癲癇遺傳背景的認識，有助於製定個性化的醫療策略。

研究的局限性

單中心研究，缺乏血清AEDs水平測定和有限的研究變量。

埃及非損傷性癲癇兒童和青少年與健康對照在頻率方麵無顯著差異SCN1A-A3184G多態性。我們認為AG基因型之間有顯著的相關性SCN1A-A3184G多態性與難治性癲癇的一些預測因子。的SCN1A-A3184G基因型可能影響aed的選擇。還需要多中心的大規模研究來驗證我們的發現。

在當前的研究中生成的數據集可在Mendeley數據中獲得:https://doi.org/10.17632/mkjprydvst.1

aed:

抗癲癇藥物

腦電圖:

腦電圖

聚合酶鏈反應:

聚合酶鏈反應

視交叉上核:

鈉離子通道

SCN1A:

鈉通道，α亞基1

SNP:

單核苷酸多態性

SPSS:

《社會科學統計彙編》

我們非常感謝曼蘇拉大學醫學院兒科神經內科前主任Mostafa El Ayouty教授在接觸患者和獲取數據方麵所發揮的幫助和支持作用。

科學、技術和創新資助局(STDF)與埃及知識銀行(EKB)合作提供開放獲取資金。沒有收到任何資金、贈款或其他支持。

作者和聯係

1. 埃及曼蘇爾拉曼蘇爾拉大學醫學院兒科

   Esraa Ghazala和Yahya Wahba

2. 埃及曼蘇爾拉曼蘇爾拉大學醫學院臨床病理科(血液學)

   Doaa a薩因

貢獻

所有作者都對研究的設計和構思做出了貢獻。材料的製備，數據的收集和分析由EG和YW進行。分子分析由DAS完成。初稿由YW撰寫，所有作者都對之前的版本進行了評論。所有作者閱讀並批準了最終稿件。

相應的作者

對應到Yahya·丁．

倫理批準和同意參與

本研究根據《赫爾辛基宣言》的原則進行，並獲得埃及曼蘇拉大學醫學院機構研究委員會(代碼號:MS.20.02.1041)的批準。獲得研究參與者的父母和/或法定監護人的書麵知情同意。

同意出版

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有利益衝突。

出版商的注意

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