新的DNA變異GPR54家族中樞性性早熟的基因研究

背景

青春期可以被認為是一個成熟過程的終點，它是由基因和環境因素在產前和產後發育過程中的動態相互作用所定義的。Kisspeptin/G蛋白偶聯受體-54，是GnRH神經元必不可少的看門人和調節器，是青春期開始的關鍵因素。GPR54基因功能突變的缺失和獲得分別與促性腺功能減退和性早熟有關。本研究旨在評估GPR54在家族性早熟中的變化。

方法

從25例家族性性早熟患者外周血中提取基因組DNA。編碼外顯子1-5GPR54采用聚合酶鏈式反應(PCR)對基因進行擴增，並對擴增產物進行純化和測序。使用Sequencher序列比對軟件將DNA序列與人類GenBank GPR54序列進行比較。

結果

我們檢測到三種不同的單核苷酸多態性GPR54: rs10407968 (24A > T) 13名受試者(52%);16名受試者(64%)發現rs3050132 (1091 T > A)多態性，1名受試者(4%)發現492C > G多態性，3名受試者(12%)未發現snp。GPR54基因未發現突變。

結論

鑒於在本研究中88%的受試者中存在snp，其snp之間可能存在某種關係GPR54基因與家族性早熟。需要進一步的研究來調查這種可能性，以及這些多態性的潛在功能影響。

青春期是一個複雜的生物過程，可能受到遺傳、營養、環境和社會經濟因素的影響。青春期由下丘腦搏動促性腺激素釋放激素(GnRH)的激活開始，隨後垂體促性腺激素分泌和性腺激素產生。早熟被定義為在女孩8歲和男孩9歲之前第二性征的發展，被分類為促性腺激素依賴或獨立。促性腺激素依賴性(中樞性)性早熟在女孩中有顯著的優勢，大多數病例被認為是特發性的。遺傳因素對青春期開始時間有重要影響。在最近的研究中，常染色體顯性遺傳已被報道為不完全性別依賴外顯[1，並且已經確定了幾種影響青春期的基因突變[2］．激活G蛋白偶聯受體及其配體kisspeptin的突變GPR54(NM-032551)和KiSS1基因分別被確認為中樞性性早熟的原因[3.，4，5］．由kisspeptin激活介導的GnRH分泌GPR54，也被稱為KiSS1R, AXOR12和OT7T175，負責青春期的開始[6，7］．的GPR54該基因位於19q13.3位點附近，長度約3kb，有5個外顯子被4個內含子打斷，包含一個1197 bps的開放閱讀框(ORF)，編碼一個包含398個氨基酸的蛋白質。GPR54在哺乳動物中是進化保守的嗎GPR54山羊、豬、牛和綿羊的死亡率高於其他哺乳動物，如人、大鼠和老鼠[8，9］．Kisspeptin是近期在激素控製生殖方麵的發現[10，11］．激活GPR54顯然足以觸發導致青春期開始的神經內分泌事件[12］．本研究的目的是評估遺傳變異的發生率GPR54在伊朗性早熟家族病例中首次發現這種基因。我們評估了225例中樞性性早熟患者，並選擇了25例家族性中樞性性早熟患者GPR54基因突變研究。

我們評估了從Imam Reza醫院兒科招募的25名家族中樞性性早熟(CPP)受試者。研究方案得到了馬什哈德醫科大學人類研究倫理委員會的批準。CPP的診斷依據如下標準:女童8歲前乳房發育，男童9歲前睾丸增大，由兒科內分泌科醫生根據Tanner分期係統進行評估。通過Greulich和Pyle方法測量年齡大於實際年齡1歲以上的晚期骨齡。促性腺激素水平增加，包括黃體生成素(LH)大於4.5 mIU/mL，促卵泡刺激素(FSH)大於7 mIU/mL, LH/FSH比大於1。采用免疫放射測定法(IRA)測定激素水平。根據臨床表現和激素水平進行GnRH刺激試驗;將其與年齡相關的參考水平進行比較:雌二醇大於20 pg/mL，睾酮大於300 ng/dL。與青春期相適應的性腺超聲表現:女性的子宮和卵巢尺寸分別大於40mm和25mm，男性的睾丸長度和體積分別大於30mm和3cc。納入標準包括家庭中是否有其他CPP病例，一級親屬的女性在10歲以下第一次月經的年齡，一級親屬的男性在13歲前第一次完全剃麵的年齡。 To exclude possible brain abnormalities, magnetic resonance imaging was performed in females under five years and all males. Moreover, the cases with adrenal hyperplasia, CNS tumor, and ovarian cyst were also excluded from the present study. After the confirmation of CPP, we selected 25 subjects with familial CPP (Table1)．從這些受試者的外周血中提取基因組DNA [13］．編碼外顯子1-5和內含子/外顯子邊界GPR54使用5對引物組合，通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行擴增。通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離評估PCR產物的大小和純度，並根據製造商的協議使用DNA凝膠提取試劑盒(INVITEK)對產物進行純化。使用Applied Biosystems ABI 3730 XL自動DNA測序儀對純化擴增子進行雙向測序。將這些序列與人類GenBank的序列進行比較GPR54使用Sequencher序列比對軟件(版本4.10.1)。

受試者在確診時的平均年齡為5.76±1.2歲。兩名受試者是雙胞胎，兩名女性在5歲和7歲時首次月經。大多數受試者的兄弟姐妹有性早熟，其餘的在第一表兄妹中有CPP家族史。診斷時的身高和體重在年齡的第75百分位以上，所有受試者的骨齡都提前(7.2±1.5歲)。所有女孩的乳房和頭發發育，平均性成熟評分(SMRs)階段為2-3歲。23例受試者中，LH和FSH的平均濃度分別為6±1.3 mIU/mL和9.5±2.2 mIU/mL。兩名受試者進行GnRH刺激試驗，FSH和LH分別為29和7.8 mIU/mL。所有受試者的超聲檢查結果與青春期一致。雖然，沒有任何突變GPR54，檢測到三種不同的snp。52%(13/25)的受試者在第24個核苷酸(rs10407968)處出現A變為G的同義多態性(圖4)。1)．Rs3050132也是a對T在第5外顯子核苷酸1091處的雜合取代，導致亮氨酸在密碼子364處被組氨酸取代，這在64%(16/25)的病例中被觀察到(圖1)。2)．同義的492 C to G SNP也首次在一個受試者中被檢測到(圖1)。3.)．一般來說，22例(88%)受試者中發現了snp，其中8例(32%)有兩個不同的snp。外顯子3和4未檢測到snp。

同義多態性將A在核苷酸24處改為G (rs10407968)

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A在第5外顯子核苷酸1091處雜合取代T

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同義的492 C - G SNP首次作為一個新的多態性被發現

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促性腺激素依賴性CPP是由下丘腦-垂體-性腺軸過早成熟引起的，它模擬了青春期生理性發育，比正常年齡更早，導致第二性征的發展、線性生長加速、骨齡提前、骨骺過早閉合和身材矮小[14］．這種情況發生在女孩身上的幾率是男孩的5 - 10倍，大多數女孩的性早熟是特發性的[15］．家庭成員擁有相似的青春期模式和發病年齡，這一事實表明，遺傳因素在青春期過程的發病機製中起著作用[16］．青春期時間受到基因的強烈影響，但尚未發現單個相關基因。青春期發作的遺傳調控很可能是由多個基因的疊加效應造成的，但特發性CPP可能存在單基因原因，如家族性ICPP的病例已被報道。KiSS1和KiSS1R基因突變影響青春期開始和GnRH分泌，可能引起單基因ICPP [17］．盡管GnRH是青春期發生和發展的主要激素，遺傳因素也很重要。到目前為止，與青春期發育異常相關的基因已經被確定，其中大多數導致孤立的促性腺機能減退症[6，7，18，19，20.，21，22，23，24]，但它們也被認為是某些突變導致青春期早熟的候選基因。到目前為止，KiSS1和GPR54已被證實為中樞性性早熟的原因[4，22，23，24，25］．在目前的研究中GPR54對25名伊朗家族性CPP患者的基因變異進行了檢測。雖然，沒有任何突變GPR54，檢測到三種不同的多態性。52%的受試者中發現rs10407968 (24a > T)， 64%的受試者中發現rs3050132 (109 T > A)， 1名受試者中發現一個新的SNP (492 C > G)。Rs10407968 (c.24A > G)和rs3050132(c.1091 T > A)的多態性已在其他民族中被發現[20.]，而c.492C > G (p.L164 L)此前未見報道。KO JM等人對101名患有中樞性性早熟的韓國女孩的研究發現了四種多態性。其中，GNRH1中的C.196 C > T和GNRH2中的C.546 T > C是新發現的[2］．另一份來自韓國的關於非家族女孩的報告顯示了7個多態和一個(c.1091 T > a)錯義突變。這種誤義變異誘導p.的氨基酸取代[26］．我們在88%的研究對象中發現了多態性。我們認為家族性早熟的多態率可能增加。據我們所知，這項研究是首次對家族性CPP進行評估，也是首次對伊朗人群CPP進行研究。我們的研究對象數量有限，因為我們選擇了CPP患者，他們的兄弟姐妹或表兄弟姐妹患有性早熟。在Luan對272名患有中樞性性早熟的中國女孩的研究中，發現了8個多態性，其中隻有一個(12.5%)是新的[27]，但在我們的研究中發現的新多態性占所有檢測到的多態性的30%，這可能與家族曆史有關。

的GPR54基因在青春期過程中起著關鍵作用。據推測，該基因的大多數突變都是致命的;因此，我們期望在GPR54．我們在88%的研究對象中發現了snp, 32%的研究對象有兩種多態性。這很可能是snp和GPR54基因功能，影響家族中樞性性早熟。這一假設需要在更大的樣本量上進一步研究。

CPP:

中樞性性早熟

FSH:

促卵泡激素

促:

促性腺激素釋放激素

ICPP:

特發性中樞性早熟

艾拉:

免疫放射測定法

LH:

促黃體激素

子:

開放式閱讀架

聚合酶鏈反應:

聚合酶鏈反應

單核苷酸多態性:

單核苷酸多態性

我們感謝馬什哈德醫科大學布阿裏研究所人類遺傳學係的科學合作者所作的貢獻。

資金

一個也沒有。

數據和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的數據集可根據合理要求從通訊作者處獲得。

作者和隸屬關係

1. 伊朗馬什哈德醫學院伊瑪目禮薩醫院兒科內分泌和代謝科

   Nosrat ghemi & Rahim Vakili

2. 伊朗馬什哈德醫學院馬什哈德大學免疫學研究中心

   Martha Ghahraman和Fatemeh Fardi Golyan

3. 伊朗馬什哈德醫學院馬什哈德大學醫學遺傳學研究中心

   Martha Ghahraman, Fatemeh Fardi Golyan和Mohammad Reza Abbaszadegan

4. 伊朗Birjand醫科大學Valiasr醫院兒科

   Samaneh Noroozi Asl

5. 伊朗馬什哈德馬什哈德醫科大學醫學院現代科學和技術係

   Meysam Moghbeli

貢獻

NG、MG、MM和FFG參與了實驗和起草。SNA和RV參與樣本采集。MRA監督了該項目。所有作者已閱讀並確認了稿件內容。

相應的作者

對應到Mohammad Reza Abbaszadegan．

倫理批準和同意參與

所有參與者(法定監護人)都填寫了經馬什哈德醫科大學倫理委員會批準的知情同意書。

發表同意書

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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