表麵活性蛋白C突變與中國兒童間質性肺病的臨床和遺傳譜

背景

表麵活性劑蛋白C基因突變(SFTPC)導致間質性肺病(ILD)。我們的目的是描述與此相關的中國兒童ILD的臨床和遺傳譜SFTPC突變。

方法

6例中國兒童ILD雜合子為SFTPC包括突變。通過新一代測序對導致表麵活性劑功能障礙的候選基因進行測序。積累的SFTPC產生了新的突變，並瞬時轉染到A549細胞中。Western blotting和免疫熒光技術對突變表麵活性劑蛋白C (SP-C)的功能特征進行了評價。

結果

發病年齡為7天至15個月。所有病例都需要補充氧氣。肺外表現最顯著的是發育不良(5/6)。長期應用羥氯喹治療肺部疾病4例，其中2例療效良好。在6例患者中鑒定出3個突變:4例I73T突變，1例D105G突變，1例Y113H突變。3例患者的突變是遺傳的，3例是重新產生的。Western blotting顯示突變SP-C (D105G和Y113H)與野生型完全不同。免疫熒光顯示突變蛋白SP-C (D105G)很少轉運到層狀體，但很好地定位於早期的內小體，這與野生型蛋白形成鮮明對比。

結論

SFTPC突變是中國兒童ILD發病的重要原因。I73T是常見的SFTPC與表麵活性蛋白C突變相關的中國ILD患兒突變。

兒童間質性肺疾病(ILD)是一組異質性呼吸疾病，其特征是氣體交換受損和彌漫性浸潤[1］．在兒童中，ILD最常在出生後的第一年被診斷，遺傳實體占主導地位[2］．在過去的十年中，人們在了解兒童ILD (chILD)的潛在原因方麵取得了重大進展，例如表麵活性劑功能障礙的遺傳性疾病，這是由對肺表麵活性劑的功能和代謝至關重要的基因突變引起的[3.］．這些基因中包括表麵活性劑蛋白C基因(SFTPC)位於染色體8p21上。其編碼蛋白表麵活性劑蛋白C (SP-C)是一種疏水35氨基酸多肽，由肺泡II型上皮細胞分泌到肺泡間隙，以幫助降低表麵張力[4］．自從Nogee等人首次報道了一例由大腸杆菌引起的病例SFTPC2001年的突變[5]的基因突變超過60個SFTPC已在兒童ILD患者中發現。

肺部疾病引起的不同SFTPC突變差異很大，從新生兒的呼吸窘迫綜合征(RDS)到成人的ILD [6，7］．然而，到目前為止，報告的病例中有很大一部分是高加索人或非洲人後裔。本港隻錄得少數源自亞洲的個案[8，9，10］．不同地域和種族的患者在臨床和遺傳譜上是否存在差異尚不清楚。隨著人們對這種疾病認識的提高和診斷技術的進步，雖然很罕見，但我們發現SFTPC在中國人群中，基因突變在早期發病的原因不明的ILD中占很大比例。最近，陳傑等。[11]報道了18例表麵活性劑功能障礙的中國病例。在15名患者中SFTPC突變，鑒定出5種不同的突變。然而，關於中國患者的基因型、治療選擇和治療反應的信息仍然有限。在這裏，我們報告了6例中國患者的臨床特征和遺傳學結果SFTPC擴大基因和臨床範圍的突變。

病人

本研究的研究對象是2013 - 2018年在複旦大學兒童醫院實驗室經臨床診斷為chILD並懷疑存在遺傳表麵活性物質功能障礙的有症狀嬰兒和兒童，然後轉診進行候選基因測序。根據美國胸科學會指南[12]，如符合以下四項標準中的至少三項，即視為已懷孕:(1)呼吸道症狀(咳嗽、呼吸急促及/或困難，或運動不耐受);(2)呼吸體征(呼吸過速、雜音、縮回、指棒、發育不全或呼吸衰竭);(3)血氧不足;(4)胸片或CT掃描顯示彌漫性異常。同時，通過超聲心動圖、病原體、自身免疫性抗體、免疫缺陷篩查，排除可引起ILD的常見疾病作為初步診斷。研究過程中收集臨床資料。本研究得到複旦大學兒童醫院倫理委員會的批準。獲得患者所有父母或監護人的書麵知情同意。

基因分析

使用QIAamp DNA血液迷你試劑盒(Qiagen, Hilden, Germany)從患者及其父母的血液中分離基因組DNA。致病基因的分子分析SFTPB，SFTPC，ABCA3，NKX2-1，CSF2RA而且CSF2RB通過使用Ion Torrent PGM (Life Technologies)自行設計的基因麵板進行。靶向的基因組區域覆蓋了這六個基因的外顯子及其側翼序列，這些基因負責表麵活性劑功能障礙。文庫製備采用Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technologies)進行多重擴增。在Ion Torrent PGM平台上使用316 v2芯片(Life Technologies)進行測序。我們使用Torrent Suite軟件(Life Technologies)來比較基本調用。然後，我們使用NextGENe軟件(SoftGenetics)讀取比對，並調用人類參考基因組hg19 (NCBI)的變體。然後將這些變體與dbSNP進行比較。采用MutationTaster、SIFT和PolyPhen2對新變異進行分析。

用3500XL遺傳分析儀(應用生物係統公司)對變異進行PCR驗證，然後進行直接Sanger測序。

功能分析SFTPCD105G突變

用來描述的方法SFTPCD105G突變等SFTPCcDNA表達構建、A549細胞係轉染、Western blotting和免疫熒光已在之前報道[13］．

用於構建突變體Flag/SP-C^D105G，采用KOD Plus mutagenesis Kit (Toyobo, Japan)， pCDH-EGFP-Flag/SP-C進行反PCR誘變^WT模板的:作為模板的用於誘變的5 '引物:GCTACCAGCAGCTGCTGATC。3 '(反向)引物:CATACACCACGAGGCCAGTG。所有結構均經Sanger測序確認。

臨床表現

從2013年到2018年，45名患者被轉診進行候選基因測序。發病年齡0月~ 9歲。其中26名男性，19名女性。雜合子6例(6/ 45,13.3%)SFTPC對突變進行了鑒定(表1)．既往報道1例患者(患者3)[13]，但由於額外的隨訪信息而被納入本研究。6例患者均為中國漢族，足月出生，妊娠、分娩均無異常。有三男三女。患者發病年齡SFTPC突變範圍從7天到15個月(中位數2.5個月)，似乎早於沒有表麵活性劑功能障礙的患者(中位數1.2年)。表麵活性物質功能障礙患者與無表麵活性物質功能障礙患者在咳嗽、呼吸急促、發紺等症狀和體征上無差異。然而，失敗的茁壯成長更普遍的患者SFPTC突變(5/6)高於無表麵活性劑功能障礙(12/39)。

遺傳的結果

在6例患者中，4例患者攜帶熱點突變I73T，其中2例為遺傳，2例為新生(表2)2)．患者2是唯一一位在1歲時有兄弟ILD家族史的患者。在5號患者中，我們發現了曾經報道過的突變D105G [14］．攜帶相同突變的父親和妹妹均無症狀。攜帶新型突變Y113H的患者3既往有報道[13］．

後續

經驗性治療如皮質類固醇，利尿劑，抗生素，氨茶堿和心髒刺激時，需要在惡化期間使用。4例患者給予羥氯喹作為肺部疾病的長期治療(表2)3.)．其中兩個反應良好，隨後恢複了生長，並停止了氧氣供應。1例(患者6)部分反應為需氧量下降，但由於食物過敏引起反複腹瀉，體重增加不明顯。至於總體結果，4例患者存活下來並有中度或顯著改善，2例患者分別在8個月和22個月時死亡。

新突變的功能分析

D105G突變僅由Willander等人報道過一次。[14然而，在那篇報道中，兩名ILD患者攜帶的突變遺傳自他們無症狀的父母，這與我們的報道相似。此外，目前還沒有該突變的功能數據。因此，為了確定突變的致病性，我們對轉染野生型和D105G突變體的A549細胞進行了Western blotting和免疫熒光SFTPC表達結構。

識別pro - c之間潛在的處理差異^WT, proSP-C^Y113H和proSP-C^D105G瞬時轉染Flag/SP-C的A549細胞裂解液^WT國旗/ SP-C^Y113H和旗幟/ SP-C^D105G用Western blotting分析表達結構。如圖所示。1與pro - c相比^WT， pro - c缺失多個波段^Y113H和proSP-C^D105G．與此同時，在20 kDa處觀測到一個額外的p - c帶^D105G．

免疫熒光顯示表達pro - c的A549細胞內原蛋白的定位存在差異^WT和proSP-C^D105G(無花果。2)．ProSP-C^WT定位於CD63(層狀體和溶酶體的標記物)陽性和EEA1(早期核內體的標記物)陰性囊泡，這是野生型pro - c的預期目標囊泡。相反，pro - c^D105G幾乎與CD63共定位，但與EEA1定位良好，提示早期核內體的異常轉運和積累。

Y113H突變的功能分析已在前麵描述[13］．簡單地說，除了我們上麵提到的Western blotting顯示的不同條帶模式外，透射電鏡的超微結構分析顯示，在表達普洛斯- c的細胞中，細胞質細胞器紊亂，有中空或偏心填充的包體^Y113H．免疫熒光顯示pro - c^Y113H很少轉運到板層體，但很好地定位於早期的核內體，這與野生型蛋白形成鮮明對比。

識別SFTPC突變導致了在嬰兒和兒童間質性肺病診斷方麵的重大進展。由於缺乏診斷技術，在過去的幾十年裏，SP-C功能障礙患者經常被誤診。在本研究中，我們描述了6例具有詳細臨床和遺傳信息的ILD患者，這可能有助於在臨床實踐中識別此類罕見病例提供可識別的模式。

在我們的研究中，大多數患者在出生後一年內出現症狀，然後逐漸發展為氧氣依賴，胸部CT顯示為磨玻璃樣。這與西方國家兒科中心報告的其他研究一致[15，16］．我們的研究表明，早期的發病年齡和更普遍的失敗茁壯成長的群體SFTPC突變。有這些特征的ILD患者應優先轉診進行遺傳分析。

個體的嚴重程度SFTPC突變差異很大，從新生兒的嚴重RDS到成人的輕度間質性肺病[6，17，18］．在我們的報告中，隨訪的臨床結果從健康(3歲)到死亡(8歲和22個月)不等。羥氯喹已被報道改善病例的臨床狀態SFTPC突變。在一些病例係列中，50 - 100%的患者對羥氯喹治療反應良好[16，19，20.］．羥氯喹的確切作用機製尚不清楚。除了具有抗炎特性外，羥氯喹已被證明可抑製SP-C前體的細胞內加工[21]，這可能解釋了它的治療效果。50%(2/4)患者對羥氯喹反應良好(分別從出生後11個月和13個月開始)，1例患者部分反應(從出生後24個月開始)。然而，應該指出的是，在唯一一例對羥氯喹無反應的病例中(從出生7個月開始)，治療剛開始1個月，直到他死於肺加重。目前仍很少有研究中心選擇羥氯喹治療由此引起的ILD患者SFTPC中國的突變。在未來，需要更多的病例和長期隨訪來確定療效。

在基因方麵，我們在6例患者中發現了3個不同的突變，包括2個已知突變和1個新突變。I73T是最常見的突變，占我們患者的66.7%(4/6)，這與其他文獻一致(28-68%)[15，20.，22］．一半病例的突變遺傳自父母，隻有1例有家族史，提示外顯不完全。這種疾病不完全外顯的機製仍不清楚。據報道，雜合度為ABCA3(另一種導致表麵活性物質功能障礙的基因)突變會改變個體肺部疾病的嚴重程度SFTPC突變表明可能涉及修飾基因[23］．此外，Kaltenborn等人[24]發現呼吸道合胞病毒感染增強了肺上皮細胞分化喪失的突變效應ABCA3突變。本研究提示，病毒感染等環境因素也可能在調節病程中起關鍵作用，從而導致外顯率不完全的現象。

曾有報道在患者5中發現D105G突變[14］．然而，同樣攜帶突變的患者的父親和妹妹沒有顯示出任何肺部疾病的跡象，這讓我們懷疑突變的致病性。此外，目前還沒有該突變的功能數據。結合新突變Y113H進行體外功能研究。根據之前的研究，很多SFTPC突變如外顯子4缺失導致錯誤折疊的pro - c長期積累，導致內質網(ER)應激和肺泡II型細胞凋亡[25，26］．在我們的Western blotting分析中，有多個pro - c條帶^Y113H和proSP-C^D105G與野生型原蛋白相比，缺失或顯著減少，這表明兩種突變蛋白的蛋白質加工都存在異常。然而，pro - c在20 kDa處觀察到一個累積的原蛋白^D105G而不是對pro - c^Y113H表明不同的原蛋白加工。轉染A549細胞的免疫熒光檢測顯示pro - c^Y113H和proSP-C^D105G兩者主要與EEA1共定位，但不與板層體標記CD63共定位。所以我們進行推測，不像pro - c^WT通過層狀體與質膜融合分泌，然後主要由肺泡巨噬細胞分解，錯誤折疊的pro - c^Y113H和proSP-C^D105G被內吞成核內體。ProSP-C^D105G可能觸發未折疊蛋白反應並導致內質網應激，而pro - c^Y113H如前所述，可被泛素-蛋白酶體係統降解[13］．D105G與Y113H分子發病機製的差異可能部分解釋了患者5家族發生不完全外顯而患者3家族未發生外顯的原因。

該研究的一個局限性是沒有這些患者的肺樣本。因此，在體內關於突變SP-C表達和肺泡II型細胞超微結構的數據尚不清楚。此外，由於本病的罕見性，我們的研究樣本量有限，未來還需要進一步的多中心研究。此外，需要較長的隨訪期來確定患者的長期結果和治療的療效。

我們的研究證實了SFTPC在中國人群中，基因突變是導致兒童ILD的重要原因。I73T也是中國ILD患兒的常見突變。一部分病人有SFTPC羥氯喹治療有利於突變。需要進一步的多中心縱向研究來研究中國人群的表型-基因型相關性和治療效果。

數據集可從相應的作者在合理的要求。

HCQ:

羥氯喹

ILD:

間質性肺病

PH值:

肺動脈高壓

遠端控製設備:

右心增大

RDS:

呼吸窘迫綜合征

SFTPC:

表麵活性劑蛋白C基因

SP-C:

表麵活性劑蛋白C

我們要感謝所有同意參與這項研究的家長。

本研究由國家自然科學基金(No.8167150)、上海市人才發展基金(201450)資助。

作者指出

1. 大洪和戴丹對這項工作有同樣的貢獻。

作者及隸屬關係

1. 201102上海市萬源路399號複旦大學附屬兒童醫院呼吸內科

   洪達，劉靜，張聰聰，金婷婷，石燕燕，蔣高麗，梅梅，王立波，錢麗玲

2. 上海市萬源路399號複旦大學兒童醫院，郵編201102

   丹戴

貢獻

DH和DD設計了這項研究，起草了手稿，分析了數據，並對工作做出了同樣的貢獻。JL, CZ, TJ, YS, GJ, MM和LW收集數據。LQ參與研究設計並協調研究。所有作者都閱讀並批準了最終的手稿。

相應的作者

對應到醴陵錢．

倫理批準並同意參與

本研究得到複旦大學兒童醫院倫理委員會的批準。獲得患者所有父母或監護人的書麵知情同意。

發表同意書

所有作者都同意發表。

相互競爭的利益

作者宣稱他們之間沒有利益衝突。

出版商的注意

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