早期診斷兒童癲癇遺傳原因的定向重測序:來自“超越癲癇”項目的意大利經驗

背景

兒童癲癇是一個異質性的條件組不同的診斷標準，處理和結果。晚期嬰兒2型神經蠟樣脂褐素病(CLN2)是一種由雙等位基因引起的神經退行性疾病TPP1變體。這種疾病表現出微妙和相對非特異性的症狀，與更常見的兒童癲癇相似，隨後出現精神運動功能迅速惡化和耐藥癲癇。及時診斷對采取適當的治療和疾病管理戰略至關重要。

方法

這是一項前瞻性的、多中心的研究，研究了靶向重測序在早期識別兒童癲癇的遺傳原因方麵的效率，特別是在CLN2方麵。在表型表征後，對21名年齡在24至60個月之間有神經發育異常的意大利兒童進行283基因下一代測序麵板，在2歲後經曆第一次無端癲癇發作。

結果

入組時的平均年齡為39.9個月，癲癇發作時的平均年齡為30.9個月，癲癇發作和靶向重測序之間的平均時間間隔為9個月。21例患者中有4例實現了遺傳確認，診斷率為19%。在一種情況下，純合剪接受體變異C .509- 1g > C InTPP1確診為CLN2。三種致病變異MECP2在3例患者中，包括1例單基因測序陰性女孩的移碼變異c.1157_1186delinsA (p.l leu386hisfs *9)。21例(52.4%)個體中有11例(VUS)發現意義不明的變異，而在其餘6例受試者中未觀察到有臨床意義的變異。

結論

我們的研究結果支持目標重測序在識別兒童癲癇的遺傳原因方麵的有效性，並表明該技術可能在CLN2和其他神經發育條件的早期檢測中成功。

癲癇是最常見的神經係統疾病之一，影響著全球約5000萬人(世界衛生組織，2017年)，兒童發病率最高。每10萬名2歲以下兒童中約有70名受到影響[1］．70-80%的病例可確定有明確的遺傳原因，包括單基因和多基因因素[2］．癲癇的遺傳學很複雜，已有幾種基因檢測方法[3.，4］．詳細的病史記錄和準確的表型表征在選擇最合適的檢測方法以及對結果的解釋方麵發揮著相關作用[4］．在精準醫療時代，癲癇病的遺傳病因的建立對於患者獲得基於病因的治療和管理至關重要[4］．

2型晚期嬰兒神經元蠟樣脂褐變病(CLN2, OMIM #204500)是一種極其罕見的兒童神經退行性疾病，估計發病率低於0.5 / 10萬活產[5，6]在斯堪的納維亞的患病率估計為百萬分之0.6-0.7 [7］．這種情況是由雙等位基因突變引起的TPP1(OMIM *607998)，編碼名為三肽基肽酶I的溶酶體肽酶(TPP1, NM_000391.3) [8，9，10，11，12，13］．該酶催化溶酶體中降解的小肽裂解氨基端三肽，並具有溫和的肽內酶活性[13，14］．TPP1缺乏導致溶酶體內自身熒光存儲材料(蠟質脂質化)積累和神經元丟失[15］．患有CLN2的兒童最初可能出現微妙和非特異性的症狀，如語言表達延遲和運動障礙，但不可避免地會出現反複發作和認知功能迅速惡化[10，11，12］．

診斷延遲在CLN2中很常見，因為早期症狀相對非特異性，與更常見的兒科癲癇相似。大多數兒童在5歲左右被確診，[5]在癲癇發作後的平均時間間隔為22.7個月[16］．通常情況下，患者首先由兒科神經學家或兒童神經精神病學家進行評估，一般兒科醫生較少進行評估，癲癇是首批臨床體征之一(BioMarin，個人溝通，2019年7月)。在這一階段，基因檢測非常重要，因為CLN2的早期遺傳診斷將允許在患者出現特征性精神運動倒退之前開始鞘內酶替代治療(ERT)，使用生物合成TPP1 (Cerliponase alfa)。事實上，這種療法可以減緩導致疾病進展的大腦退化過程[17，18］．

我們在一個選定的兒童癲癇隊列中使用靶向重測序技術來研究早期基因檢測在及時診斷CLN2和以早期癲癇為特征的其他遺傳神經發育障礙方麵的作用。

“超越癲癇”是一個專注於使用基於下一代測序(NGS)的技術來早期發現兒童癲癇的遺傳原因的項目。簡單地說，Blueprint Genetics和BioMarin提供了免費的NGS麵板，包括拷貝數變異(CNVs)和線粒體基因組分析，用於診斷兒童癲癇的遺傳原因。該基因組包括416個基因，在歐洲和中東用於首次無故癲癇發作的兒童[19)(https://blueprintgenetics.com/tests/panels/neurology/beyond-paediatric-epilepsy-panel/)．

該項目與國際抗癲癇聯盟遺傳學委員會一致，重點評估基因檢測在癲癇中的效用[20.]，以及目前由意大利抗癲癇聯盟提供的癲癇病兒童基因測試指南[4］．

來自SINP(意大利兒科神經學學會)合作網絡的7個意大利癲癇中心根據以下納入標準招募癲癇兒童:a)年齡在24至60個月之間;B) 2歲後第一次無故發作;c)語言延遲或倒退和/或運動障礙或倒退和/或腦電圖(EEG)異常和/或大腦磁共振成像(MRI)異常。排除了癲癇病因已知的兒童。患者數據從臨床記錄中獲得，並通過轉診臨床醫生提供的問卷收集。

在獲得父母或法定監護人的書麵知情同意後，對從外周血中提取的DNA進行“超越兒科癲癇麵板”。該小組包括283個與不同病因的癲癇相關的基因(完整列表見附加文件:補充表)1)．通過Sanger測序對鑒定的變異進行驗證。根據群體遺傳學(在常見頻率數據庫中等位基因頻率< 0.01，如gnomAD和外顯子組聚合聯盟- ExAC)、保守性(基因組進化速率分析- GERP評分)和通過一些在si工具(如，從耐受中篩選不耐受- SIFT、PolyPhen、聯合注釋依賴損耗- CADD、突變Taster、Human Splice Finder)預測對蛋白質結構和功能的影響。根據美國醫學遺傳學和基因組學學院(ACMG)指南進一步對候選變異進行分類[21］．

在3個多月的時間裏，我們納入了21例不同癲癇表型的患者，其中8例為男性(38.1%)，13例為女性(61.9%)1)．入學時的平均年齡為39.9個月(範圍57-24個月，中位數41個月)。發病年齡平均為30.9個月(範圍52-24個月，中位數27個月)。從癲癇發作到靶向重測序的平均時間間隔為9個月(範圍0-33個月，中位數5個月)。患者表現出不同的癲癇發作類型。最常見的是強直陣攣發作，21例患者中有9例(42.8%)發生強直陣攣發作，其次是8例(38.1%)患者發生肌陣攣發作(圖1)。1a).在所有受試者中，觀察到相關的神經發育異常。21例患者中18例(85.7%)診斷為語言障礙，其中4例(22.2%)為非語言障礙，6例(28.6%)診斷為運動障礙(笨拙和共濟失調)。其他常見的發現包括運動和認知延遲、行為異常(如注意力缺陷/多動和類自閉症行為)、張力不足、痙攣性雙癱、眼球震顫、睡眠障礙、先天性心髒缺陷和小頭畸形。2號和21號患者的發育技能也出現了倒退。1b)分別為24月齡和45月齡(表1)．

該隊列的表型特征。一個在我們的隊列中記錄癲癇發作類型。b最相關的相關臨床特征分布

全尺寸圖像

腦電圖檢查顯示了幾種明顯的癲癇樣異常，包括單側或雙側局灶性異常(57.1%)，多灶性異常(9.5%)和全局性異常(33.3%)1)．所有患者均行間歇性光刺激(IPS)，但僅在19號患者中誘發了癲癇樣光氧化反應(PPR)。其餘病例無光敏反應。腦MRI顯示3例患者出現非特異性異常(如脈絡膜叢囊腫、枕骨功能障礙和白質高強度)，2例患者出現Chiari I型畸形。此外，19號患者出現全腦萎縮，21號患者出現小腦萎縮。

在4例患者中發現了致病性變異，診斷率為19%。純合剪接變異C .509- 1g > C inTPP121號患者中檢出(NM_000391.3)。該變異在gnomAD中很罕見(小等位基因頻率- MAF 0.0003997)，在純合狀態下從未報道過。它被幾種矽工具預測為致病性(表2)．

根據人類剪接發現者，這TPP1變異改變了野生型受體的剪接位點，導致剪接異常。之前在經典CLN2患者中也有報道，我們患者的表型與這種類型的疾病一致[13］．此外，21號患者的分離分析顯示該變異為真純合性。三個不同的變體MECP2(OMIM * 300005, NM_004992.3)進一步鑒定。移碼c.1157_1186delinsA, p.(Leu386Hisfs*9)在gnomAD中缺失，並通過突變品嚐器預測致病。兩個錯義變體c.397C > T, p.(Arg133Cys)和c.502C > T, p.(Arg168*)在gnomAD中不存在，影響保守殘基(GERP得分分別為5.24和5.48)，並導致較高的CADD得分(分別為34和38)。根據ACMG指南，所有這些變異都被歸類為IV類或V類(致病性或可能致病性)(表2)．在Rett綜合征中，早期截斷變異體和大插入缺失(INDEL)變異體通常與嚴重的表型相關，而錯義變異體和晚期截斷變異體與較輕的臨床特征相關[22］．然而，在攜帶相同基因的患者中觀察到表型變異MECP2變體。在我們的病例中(患者#2、#12和#13)沒有發現明顯的基因型-表型相關性，因為攜帶移碼和停止增益變異的個體(患者#2和#13分別)顯示出與攜帶錯義的受試者相似的表型MECP2變體(病人# 12)。

在12個不同基因中存在意義不明的變異(VUS) (ALG13，SCN9A，RELN，SYNJ1，SPATA5，COL4A1，PCDH19，WDR26，CLN3，PRODH，KIF1A，GRIN2B)在21例患者中有11例(52.4%)進一步發現(見補充文件:補充表)2)．最終，在剩下的28.6%的病例中沒有檢測到顯著的變異。

我們在一個選定的兒童癲癇隊列中使用靶向重測序技術來研究基因檢測在診斷CLN2和其他以早期癲癇為特征的遺傳神經發育障礙中的影響。“超越兒科癲癇麵板”的目標是蛋白質編碼外顯子、外顯子-內含子邊界(±20 bps)和選定的非編碼和深度內含子變體[19］．這種基因檢測在檢測神經發育障礙的遺傳原因方麵特別有用，因為它可以檢測單核苷酸變異和高達220 bps的小INDEL和CNVs。然而，它不能識別平衡易位、複雜倒置和低級鑲嵌。

我們鑒定了致病性剪接變異C .509- 1g > CTPP1(NM_000391.3)為一名患有肌陣攣性癲癇、語言障礙、輕度認知障礙、震顫、失調和神經影像學異常的4歲女童。她的家族史為癲癇陰性。在三個女孩(ID #2， #12和#13)中，我們發現了致病性變異MECP2．這些受試者表現出與Rett綜合征一致的臨床表型。值得注意的是，23.8%的研究對象(ID #2、#3、#8、#13和#16)進行了先前的基因檢測，包括核型、陣列比較基因組雜交(CGH)和單基因測序，所有病例均為陰性結果。移碼變體c.1157_1186delinsA, p.(Leu386Hisfs*9) inMECP2(NM_004992.3)在之前陰性的受試者(ID #2)中檢測到MECP2測序測試。事實上，已知一些技術限製會影響桑格測序的靈敏度(例如，過度的背景噪聲和放大步驟中的錯誤)，特別是在檢測indel變體時[23］．由於NGS有多個獨立的測序讀數和生物信息學分析，進一步支持了NGS麵板的診斷能力，所以這些限製在NGS中不太相關[24］．

使用該基因麵板，在我們的研究中，陽性病例的相對百分比約為19%(4/21)。最近,Pellacani等人根據最初的設計，對靶向癲癇基因板進行了係統回顧，將其分為“臨床定製”、“商用”和“功能網絡相關”。麵板的診斷率由0至84.6%不等[25］．與“臨床定製”(平均26.1%)和“功能網絡相關”(平均10.5%)麵板相比，通過“商業”麵板確定的陽性病例數量(平均30.2%)更多[25］．我們研究中使用的NGS麵板是一種“市售”麵板，診斷率(19%)與類似麵板(範圍14-46%)一致[26，27］．特別是關於MECP2在美國，據報道NGS組對癲癇和神經發育障礙患者的診斷率約為3.5% [28］．在我們的研究中，診斷率MECP2為14%，但這一發現可能是由所使用的選擇標準和所研究的患者數量有限所解釋的。的診斷率也類似TPP1在一般人群中，患有神經發育障礙的兒童占1.4% [28，而我們的研究結果是4.7%。

NGS技術在兒童癲癇治療中非常有用，但對基因發現的正確解釋可能具有挑戰性。這與VUS患者尤其相關，盡管進行了徹底的遺傳分析和表型表征，但VUS患者可能難以解釋[4，29］．我們在已知的致病基因中發現了幾種VUS(補充表)2)，與臨床表型不一致，因此被丟棄。唯一的例外是c.3269A > G變體GRIN2B(NM_000834.3)，但親代分離顯示該變異遺傳自健康的父親。在6例病例中未檢測到候選變異，這並不排除這些受試者癲癇的可能遺傳原因，因為NGS組隻包括有限的，如果數量眾多的基因。因此，下一步將對陰性病例進行WES檢查。

CLN2的早期診斷極具挑戰性，因為其發病時的症狀相對非特異性[30.］．理想情況下，診斷應該在第一次癲癇發作時立即做出。癲癇發作是CLN2最著名的特征，盡管癲癇表型可能是可變的。的確，雖然肌陣攣發作和肌陣痙攣是CLN2的典型表現，但也可能發生其他類型的發作(例如發熱性、全身性強直陣攣、缺失、局灶性伴或不伴繼發性泛化)[31，32］．其他臨床特征可能提示CLN2，包括語言延遲(通常先於癲癇發作)、共濟失調和笨拙[5，33］．這些症狀通常建議在疾病早期進行診斷。事實上，在2-4歲時出現癲癇發作的早期語言延遲最近被認為是CLN2疾病的標誌[32］．因此，在無端癲癇發作兒童的診斷過程中，徹底的表型表征是必不可少的[4］．

腦電圖檢查可能特別有助於提高對CLN2的懷疑。事實上，早期光敏性(1-3 Hz低刺激頻率下的PPR)是CLN2的一個關鍵指標[32，34，35］．然而，並不是所有CLN2患者都存在PPR，如果腦電圖沒有盡早進行或沒有采用標準化的IPS程序，可能會錯過光敏反應[31，36，37］．在我們的研究中，所有患者都進行了IPS腦電圖檢查。癲癇樣PPR僅在19號患者中發現低刺激頻率和中刺激頻率。其餘病例無光敏反應。更具體地說，21號患者(CLN2病例)的腦電圖在低頻率時未顯示典型的PPR。

CLN2的另一個診斷線索包括腦MRI的特征性改變，如進行性腦和小腦萎縮和腦室周圍白質改變[35］．因此，患者21在46月齡時的MRI顯示腦室周圍白質高強度和小腦萎縮。2)．Johnson等人，最近顯示了從受影響較嚴重的後結構到輕度受影響的前結構的梯度。此外，他們還揭示了新的發現，這可能有助於闡明CLN2疾病早期診斷的影像學模式，如海馬結構和腦幹變薄的微妙變化，特別是涉及到橋腦結構[32］．在該患者中，從第一次癲癇發作開始的5個月內，基因麵板允許診斷為CLN2。事實上，要麼TTP1酶活性不足，要麼檢測出兩種致病性變異CLN2可診斷CLN2 [15］．分子診斷完成後，還進行了TPP1酶活性檢測，確認酶活性不足，及時啟動酶替代治療(ERT)。該患者在確診時的漢堡運動和語言(HML)量表上的運動和語言綜合評分為4分。具體來說，運動得分為2分(經常摔倒，缺乏協調能力)，語言得分為2分(她的語言技能有所倒退，但她的語言仍然可以理解)。

21號患者的腦磁共振成像(MRI)。一個軸向t2加權圖像顯示心室周圍深白質輕度高信號(細箭頭)。b軸向液體衰減反轉恢複(FLAIR)掃描顯示腦室周圍白質高強度，特別是後區(細箭頭)，皮質下白質保留髓鞘(粗箭頭)。c冠狀位t2加權掃描顯示腦室後周白質輕度高強度(細箭頭)和中度小腦萎縮(粗箭頭)。d矢狀位t1加權掃描顯示中度小腦萎縮(粗箭頭)伴靜脈腦室(星形)和大池(細箭頭)腫大。從第一次癲癇發作到核磁共振成像的時間是一個月

全尺寸圖像

我們的研究存在一些局限性。首先，我們分析了21名患者的隊列，對於一種估計發病率低於0.5 / 10萬活產的疾病來說，這個隊列太小，沒有統計學意義[5，6］．其次，入選標準被選擇為以cln2為中心，但不能被認為是這種情況的特異性。然而，我們能夠在三個患者中實現Rett綜合征的早期診斷，對這些患者的管理具有積極的意義。

“超越兒科癲癇麵板”是癲癇和神經發育障礙的兒科患者的一個強大的診斷工具。我們的觀察表明，這種基於ngs的方法可能被證明在CLN2的早期診斷中是有效的，允許及時采用最準確的治療策略(包括ERT)。這些發現也暗示包括TPP1在癲癇NGS組中。我們認為，在兒科神經學家和遺傳學家手中，這是一種既省錢又省時的診斷武器，特別是在臨床特征不嚴格提示某一特定疾病時。

支持本文結論的數據集包含在本文及其附加文件中。

ACMG:

美國醫學遺傳學與基因組學學院

B:

兩國

CADD:

聯合注釋依賴耗竭

CD:

認知延遲

全息:

比較基因組雜交

CLN2:

晚期嬰兒神經元蠟樣脂褐素病2型

基因拷貝數異變:

拷貝數變異

EA:

癲癇樣的異常

腦電圖:

腦電圖

導:

酶替代療法

ExAC:

外顯子組聚合財團

F:

女

天賦:

流體衰減反演恢複

GERP:

基因組進化速率譜

HET:

雜合的

HML:

漢堡汽車和語言量表

力宏:

純合子的

HSF:

人類拚接儀

INDELs:

少量的插入和刪除

“誘導多能性”:

斷斷續續的光刺激

李:

左

LD:

語言遲緩

M:

男性

加:

輕微的等位基因頻率

MD:

運動發育遲緩

核磁共振成像:

磁共振成像

門店:

新一代測序

公司:

不言語

西北:

不走

人類:

在線孟德爾人類遺傳

PPR:

Photoparoxysmal響應

公關:

精神運動回歸

PvWMH:

心室周圍白質高強度

接待員:

正確的

篩選:

從容忍中分類不容忍

SINP:

意大利兒科神經學會

TC:

Tonic-clonic

TPP1:

Tripeptidyl-peptidase我

VUS開頭:

意義不明的變體

韋斯:

全外顯子組測序

研究負責人:

白質hyperintensity

XL:

x連鎖

這項工作是在DINOGMI 2018-2022年MIUR卓越係(2016年第232課)的框架內開展的。“超越癲癇”項目得到了BioMarin製藥公司的支持。

本研究未獲資助。

作者和聯係

1. 兒科神經病學和肌肉疾病組，IRCCS ' G。加斯裏尼研究所，16147年，意大利熱那亞

   Elisabetta Amadori, Marcello Scala, Giulia Sofia Cereda, Maria Stella Vari, Francesca Marchese, Carlo Minetti & Pasquale Striano

2. 熱那亞大學神經科學、康複、眼科、遺傳學、婦幼保健係，意大利熱那亞

   Elisabetta Amadori, Marcello Scala, Thea Giacomini, Carlo Minetti & Pasquale Striano

3. 意大利博洛尼亞大學S. Orsola醫院醫療和外科科學部兒童神經病學和精神科

   Veronica Di Pisa和Duccio Maria Cordelli

4. 兒童神經精神科，癲癇中心，臨床和外科神經科學和康複部，IRCSS ' G。加斯裏尼研究所，熱那亞，意大利

   Maria Margherita Mancardi和Thea Giacomini

5. 兒童神經精神科，IRCSS ' G。加斯裏尼研究所，熱那亞，意大利

   勞拉Siri

6. 意大利亞曆山德裏亞Cesare Arrigo醫院兒童神經病學和精神病學

   菲比安娜Vercellino

7. 英國阿伯丁皇家阿伯丁兒童醫院兒科神經內科

   多梅尼科Serino

8. 兒童神經病學和精神病學，ASL CN1，庫尼奧，意大利

   多梅尼科Serino

9. 意大利比薩大學比薩大學Azienda Ospedaliera比薩大學兒科神經學

   亞曆山德羅·奧爾西尼和愛麗絲·博努切利

10. 馬提尼醫院兒童神經精神科，路Tofane 71, 10141，意大利都靈

    巴尼亞斯科艾琳躊躇滿誌

11. 意大利諾瓦拉市AOU Maggiore della Carita兒童神經精神科

    阿曼達爸爸

貢獻

所有作者閱讀並批準了最終稿件。

相應的作者

對應到Pasquale Striano．

倫理批準和同意參與

基因檢測是滿足患者需求的常規臨床實踐的一部分。在納入本研究之前，父母已獲得書麵的知情同意。這項研究符合《赫爾辛基宣言》。

同意出版

不適用。

相互競爭的利益

P.S.獲得了演講費，並參與了BioMarin, Zogenyx, GW Pharmaceuticals的顧問委員會，並獲得了ENECTA BV, GW Pharmaceuticals, Kolfarma srl的研究資金。衛材。其他作者聲明沒有利益衝突。

出版商的注意

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再版和權限