高通量篩選發現脊髓性肌萎縮症患者的新突變

背景

脊髓性肌肉萎縮症(SMA)是一種常染色體隱性遺傳疾病，與嚴重的肌肉萎縮和四肢和軀幹無力有關。突變基因的發現有助於SMA的診斷和治療。

方法

收集臨床懷疑SMA的28個核心家族的83份全血樣本，進行多重結紮探針擴增(MLPA)。之後，完整的基因序列SMN1基因檢測。此外，從28例先證者中選取20例SMA患者，5例非SMA兒童作為對照組。利用Life Technologies SOLiD™技術與配偶對化學進行整個外顯子組高通量測序。

結果

22例先證者為SMA患者，3例先證者為攜帶者，3例為正常人。2個SMA家庭的2位父母有3位SMN1exon7副本。六個SMN1在83個樣本中鑒定出了單核苷酸變異(SNVs)，其中c.[84C > T]， c.[271C > T]， c.[−39A > G]和G .[70240639G > c]是新發現的。與對照組相比，在SMA患者中篩選出9102個突變。SPTA1突變c。(−41 _-40insctct),FUT5SNV c.[1001A > G]MCCC2SNV c.[−117A > G]是SMA組中最常見的3個突變(分別為95、85和75%)。

結論

我們在兩者中都發現了一些突變SMN1c.[271C > T]， c.[−41_-40insCTCT]， c.[1001A > G]和c.[−117A > G]可能與SMA的發生有關。

脊髓性肌萎縮症(SMA)是一種常染色體隱性遺傳疾病，以脊髓運動神經元退變、骨骼肌萎縮和全身無力為特征[1］．每1萬名活產嬰兒中就有1人患此病，往往導致過早死亡[2］．SMA的嚴重程度廣泛，影響嬰兒到成人。根據發病時間和疾病嚴重程度，將SMA分為4種類型(SMA1、SMA2、SMA3、SMA4)， SMA1型，發病時間在6月齡前;SMA 2，發病年齡為6 - 18個月;SMA 3, 12個月後在兒童期發病;SMA 4，成人發病[3.］．Nusinersen(商品名:Spinraza)是唯一被批準的治療脊髓性肌肉萎縮的藥物，它通過鞘內注射直接給藥到中樞神經係統[4，但必須在短時間內做出明確的診斷。遺傳譜對SMA的快速準確診斷至關重要。

SMA是由存活運動神經元的純合子破壞引起的1 (SMN1)基因的刪除、轉化或突變[1］．由於肌萎縮性脊髓硬化症是最常見的致命遺傳疾病之一，其攜帶者頻率為1 / 40到1 / 60，直接攜帶者劑量檢測對許多家庭都是有益的[5］．約96%的SMA是由純合子缺失引起的SMN1Exon7，剩下的4%的病例是由一個等位基因的點突變和另一個等位基因的缺失引起的複合雜合性或由SMN1［6］．SMN2是同源基因的SMN1作為SMA修飾符。一般來說，拷貝數SMN2是SMA患者的顯著變異，而高SMN2拷貝數趨於溫和類型[7］．此外，隨著基因測序技術的發展，越來越多的新基因或新突變被報道與SMA的發病率、嚴重程度、治療和預後有關。一項研究揭示了七種不同的變異SMN1，其中C . 824g > C和C .825- 2a > T為首次報道[8］．另一項研究發現簡要拷貝數與SMA的臨床嚴重程度呈負相關[9］．GTF2H2而且H4F5已被證明與SMA的發作和類型有關[10］．了解SMA病理的遺傳特征，有助於更好地了解和診斷，以便對越來越多的患者實施護理。

從嬰兒期到成年期，SMA的嚴重程度不同，這體現在臨床的1-4型分類體係中。此外，最近的一項研究報告指出，拷貝數SMN基因可能決定了SMA患者的病理類型。曹等人。[11]發現在不同的拷貝數SMN2， I型與2/3型的分布差異顯著(P< 0.001):當拷貝數SMN21型占75%，2/3型占25%。然而，當父母攜帶了三份SMN2，其SMA子代均為2/3型。因此，了解患者的病理遺傳特征是非常重要的，這直接影響到患者的診斷和治療。

為了進一步提高我們對SMA患者遺傳變異的認識，本研究首先使用多重連接探針擴增(multiplex ligase probe amplification, MLPA)對28個疑似SMA患者核心家係進行初步診斷，然後對其進行完整的基因序列分析SMN1通過高通量測序檢測基因，在28個核心家族中發現更多突變。隨後納入20例確診為SMA的兒童和5例非SMA的兒童，對其他相關基因進行全外顯子組篩選，以探索更多與SMA發病相關的基因和突變。

病人和樣品

2013年12月至2017年5月，我院(天津兒童醫院，天津，中國)因行走不穩而接受臨床懷疑SMA先證28例，男15例，女13例，年齡1個月至12歲不等。親本表型均正常。收集83例入選病例(先證者及其父母)3-5 ml外周血樣本。所有受試者均定期簽署基因檢測知情同意書，所有程序均符合機構和/或國家研究委員會的倫理標準。

MLPA

用鹽析法提取基因組DNA。核酸定量儀NADO DROP 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.， Waltham, USA)用於測定提取DNA的質量和數量。根據製造商的協議，使用SALSA MLPA Kit P021 (MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands)進行MLPA。MLPA產品在ABI PRISM 3130基因分析儀上運行(應用生物係統國際公司，加利福尼亞州，美國)。評價標準以試劑盒說明書為依據:正常人SMN1 exon7為2拷貝;的SMN1純合缺失患者和雜合缺失攜帶者的基因分別為0拷貝和1拷貝[12，13］．

通過高通量測序篩選SMN1基因

完整的基因組序列SMN1通過高通量測序對83例入選病例進行基因檢測。首先，使用DNeasy血液和組織試劑盒(QIAGEN, Dusseldorf, Germany)提取高分子量基因組DNA，並根據製造商的建議使用10 μg基因組DNA進行文庫生成。其次，使用Illumina HiSeq-2500平台(Illumina, California, USA)根據製造商的方案進行測序反應。平均測序深度為100×，超過96%的區域達20×。再次，將原始數據與人類基因組(NCBI build 36, hg18)進行比較，標記重複讀取，過濾低質量數據。第四，通過基因組分析工具包(GATK)算法再次校準reads的堿基質量，最終使用GATK軟件V3.0 (Eli and Edythe L. Broad Institute, Massachusetts, USA)篩選出所有DNA的單個堿基(點突變)或堿基對丟失(缺失)[14］．的質量控製_30.所有樣本的原始數據均大於85%，所有突變的等位基因頻率均大於20%。

全外顯子組高通量測序篩選

基於以往的結果，20例SMA患者的純合子缺失SMN1從28例先證者中選取外顯子7,5例非SMA兒童作為對照(2例患兒攜帶雜合子缺失SMN1Exon7和3個孩子，2SMN1exon7副本)。全外顯子組高通量測序由Life Technologies SOLiD™(版本3)技術和配偶對化學進行。20 μg高分子量基因組dna用於文庫生成。用GATK軟件對原始數據進行分析。平均測序深度為100×，超過96%的區域達20×。的質量控製_30.所有樣本的原始數據均大於85%，所有突變的等位基因頻率均大於40%。

MLPA

MLPA結果顯示22個先證者均為純合缺失SMN1exon7 (SMA患者)，3個先證者攜帶雜合缺失SMN1Exon7(攜帶者)，3個先證者和2個SMN1(正常的個人)副本。然而，一名SMA患者的母親有3例SMN1exon7拷貝，父親為攜帶者，另一例SMA患者父親為3拷貝SMN1Exon7拷貝，母親是攜帶者。我們將上述2例SMA患者分別記錄為Proband-1和Proband-2。此外，1例2歲女童攜帶者的臨床表現符合SMA，如骨骼肌萎縮、全身無力和肌電圖顯示的廣泛神經源性損傷。在這裏，航母被命名為“先證者-3號”。此外，Proband-3的父親沒有雜合缺失SMN1Exon7和exon8，母親是攜帶者。

疑似SMA家族中SMN1的新突變

在83個樣本中共鑒定出6個SMN1的單核苷酸變異(SNVs)，見表1．3個snv位於外顯子，1個位於UTR5, 2個位於內含子;c。[84 c > T], c。[271 c > T], c。(−39 > G)和G。[70240639 G > c]首先報道;c.[84C > T]和c.[462A > G]為同義突變，c.[271C > T]為止增益;c.[271C > T]引起編碼氨基酸的變化。此外，在Proband-3及其父親中發現c.[271C > T]，在17例SMA患者、2例攜帶者和2例正常人中發現c.[462A > G]。此外，1例攜帶c.[84C > T]， 1例SMA患者攜帶c.[−39A > G]， 1例SMA患者攜帶G .[70240639G > c]。

新的突變隻發生在SMA患者中

與對照組比較，純合子缺失的SMA患者共篩選出9102個突變SMN1exon7。它們位於外顯子區，隻發生在SMA患者中，不在攜帶者和正常人中。其中包含2415個基因和一些不確定基因，包含8619個snv, 267個缺失和216個插入。在這裏，除去不定基因，表中顯示了30個最頻繁的突變2(頻率≥50%)。從Table可以明顯看出這一點2隻有MCCC2錯義突變c.[1001A > G]位於第5q13號染色體上，與SMN1而且SMN2．其他與5q13無關。

由於SMA的臨床特征和突變特征都很明顯，因此診斷起來比較容易。然而，最近的一篇綜述報道，SMA的診斷過程並不總是簡單的，在所有類型的SMA中，從臨床特征的出現到診斷通常存在延遲[15］．目前，MLPA是SMA臨床診斷的金標準。然而，MLPA隻能檢測到的刪除SMN1根據基因拷貝數，不檢測點突變的SMN1．眾所周知，大約4%的SMA患者有一個SMN1帶有基因內突變的拷貝。因此，一些SMA患者不可避免地被誤診為攜帶者。此外，新療法的出現增加了對SMA早期診斷的需求，療法的批準和新生兒篩查項目迫切需要對遺傳變異有更詳細的了解[16］．在這項研究中，Proband-3有一個SMN1複製和SMN1停止增益突變c.[271C > T]，雜合缺失SMN1第7號外顯子來自她母親，而SMN1停止增益突變c.[271C > T]來自她的父親。的SMN1停止增益突變c.[271C > T]從未報道過，它導致了氨基酸的變化。雖然MLPA結果顯示Proband-3為載體，但在她身上出現了一些sma相關的臨床特征。在這裏，我們懷疑Proband-3可能是由雜合缺失引起的SMA患者SMN1外顯子7結合SMN1停止增益突變c.[271C > T]。同時，c.[271C > T]可能與SMA的發生有關。另外，[2 + 0]基因型攜帶者有兩種SMN1複製在一條染色體上，並缺失SMN1在另一條染色體上[17］．在本文中，我們發現2例患者(Proband-1和Proband-2)，父母一方為攜帶者，另一方為3例攜帶者SMN1exon7副本(Proband-1的母親和Proband-2的父親)。根據我們的研究結果，我們懷疑Proband-1的母親和Proband-2的父親可能是[2 + 0]基因型攜帶者。

SMN1而且SMN2存在於5q13染色體上，在5q13連鎖的SMA患者中，96.4%的患者表現出純合子缺失SMN1外顯子7和8或外顯子7，而3.6%的外顯子表現為複合雜合性，其中一條染色體上有微妙的突變，另一條染色體上有缺失/基因轉換[6］．由於5q染色體結構的複雜性，SMA的發病機製尚未完全闡明。例如，罕見的變異SMN2已經被一些研究描述過[18，19，20.]，一些學者認為SMN2軌跡，如鄰接刪除NAIP1基因會影響甚至改變SMA的嚴重程度[21，22］．隨著生物信息學的發展，越來越多的基因突變被發現SMN1，其中一些具有重要的臨床意義。山本等人。[23]發現4個基因內突變(p.Ala2Val、p.Trp92Ser、p.Thr274TyrfsX32和p.Tyr277Cys)，突變的位置與SMA的臨床嚴重程度相關。Ronchi等人[24描述一本小說SMN1該突變影響了外顯子7的供體剪接位點，導致了一名意大利嬰兒異常嚴重的SMA表型，並迅速導致死亡。在這篇文章中，我們找到了6SMN128個疑似SMA患者核心家族的SNVs，包括4個新的突變c.[84C > T]， c.[271C > T]， c.[−39A > G]和G .[70240639G > c]，這在以前從未報道過。此外，我們發現更多的突變結合純合缺失SMN1exons7(表2)．最常見的3個突變是插入突變c.[−41_-40insCTCT] inSPTA1exon1 (rs111674514)， SNV c.[1001A > G] inFUT5SNV c.[−117A > G] in . exon2 (rs778984)， SNV c.[−117A > G] in . exon2 (rs778984)MCCC2exon1 (rs11746722)。SPTA1編碼人紅係α -spectrin，這是一種肌動蛋白交聯和分子支架蛋白，連接質膜和肌動蛋白細胞骨架，並在確定細胞形狀、跨膜蛋白排列和細胞器組織中起作用[25，26］．突變SPTA1可導致多種遺傳性紅細胞紊亂，包括2型橢圓形紅細胞增多症、焦變紅細胞增多症和球形紅細胞溶血性貧血[27，28］．FUT5編碼人α 1,3-聚焦轉移酶，下調FUT5降低了涎酰-劉易斯抗原的表達，降低了胃癌細胞的粘附和結合能力[29］．α 1,3-聚焦轉移酶的基因轉移通過增強前列腺基質細胞的粘附性，增加了PC-3人前列腺癌細胞株的腫瘤生長[30.］．甲基crotonyl CoA羧化酶β (mc β)編碼於MCCC2中的點突變和刪除事件MCC2可導致MCC缺乏[31］．MCC缺陷是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，其臨床表現從良性到重度代謝性酸中毒和嬰兒死亡，在某些方麵與SMA有共同之處。MCCC2位於5q13染色體上，與SMN1．一些研究表明SMN1是致病基因，5q13區域的其他基因作為修飾基因(如SMN2，簡要而且GTF2H2)，與疾病嚴重程度相關[32］．突變rs111674514在SPTA1, rs778984FUT5和rs11746722MCCC2既往已發現，但臨床意義尚不明確。在這篇文章中，我們發現它們在SMA患者中廣泛存在，而在非患者中幾乎不存在。提示它們可能與SMA的發病有關。

這項研究的一個局限性是沒有使用健康兒童作為對照。原因是本研究涉及的兒童年齡較小(0 - 12歲)，許多家長由於對基因檢測了解不足，不願意讓自己健康的孩子參與研究。另一個客觀原因是測序的成本很高，所以健康孩子的父母不願意為此付費。但就整個研究的合理性而言，我們確實應該加入健康兒童作為對照，使我們的研究更加完整，這也是我們在後續相關研究中需要改進的地方。相反，采用與SMA臨床特征相似的非SMA患者作為對照，可以排除一些可能導致SMA患兒臨床特征相似的基因突變，從而使本研究的對象更加準確。使用該人群作為對照可以排除其他可能導致運動障礙的突變，並且隻保留SMA患者特有的突變。

我們發現兩者都有更多的突變SMN1和其他基因，其中一些與SMA的發病有關，如SMN1停止增益突變c.[271C > T]，該SPTA1插入突變c.[−41_-40insCTCT]，插入突變c.[−41_-40insCTCT]，插入突變c.[−41_-40insCTCT]FUT5SNV c.[1001A > G]MCCC2SNV c.[−117A > G]。

本研究中使用和/或分析的數據集可根據合理要求從通訊作者處獲得。

SMA:

脊髓性肌肉萎縮症

MLPA:

多重連接探針放大

SNVs:

單核苷酸變異

SMN：

運動神經元存活

簡要：

神經元凋亡抑製蛋白

GATK:

基因組分析工具箱

MCCβ:

甲基crotonyl輔酶a羧化酶β

我們要感謝所有參與這項研究的參與者和他們的家人。

國家自然科學基金項目[批準號81771589];天津市科技計劃項目[批準號18ZXDBSY00170];天津市衛生專業人才重點項目[批準號16KG166]。基金機構沒有參與項目設計、數據收集、分析等工作。

1. 張瑞平、顧春雨、蒲林傑對這項工作貢獻相同。

作者和聯係

1. 天津市兒童醫院兒科，天津300134

   Ruiping張

2. 天津醫科大學研究生院，天津300070

   顧春雨濮林傑

3. 天津市兒科研究所，天津市兒童醫院，天津市北辰區龍岩路238號，郵編300134

   舒建波，蔡春泉

4. 天津市出生缺陷防治重點實驗室，天津300134

   舒建波、蔡春泉

5. 300134天津市北辰區龍岩路238號天津市兒童醫院神經外科

   計算動態蔡

貢獻

CQC和JBS設計研究，起草初稿，並對初稿進行修改。RPZ參與了研究的設計，並對稿件進行了批判性的審稿。CYG和LJP收集樣本，並嚴格審查了手稿。CYG、LJP和YTM對數據進行分析、解釋和審稿。所有作者都為論文的概念或設計，或數據的獲取、分析或解釋提供了實質性的貢獻，修改了重要的知識內容的手稿，批準了最終版本，並同意對工作的所有方麵負責。

相應的作者

對應到簡帛蜀或計算動態蔡．

倫理批準和同意參與

所有受試者均簽署常規基因檢測知情同意書，並獲得天津市兒童醫院醫學倫理委員會批準。從父母處獲得書麵知情同意，並從兒童和青少年處獲得知情同意。

同意出版

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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再版和權限