女孩特發性中樞性性早熟PROKR2基因的分子篩查

背景

促運動素受體2 (PROKR2)功能喪失突變被認為是低促性腺功能減退症的原因。2017年，首例中央性早熟(CPP)引起的PROKR2在一個3.5歲的女孩中描述了功能突變的雜合獲得。目前還沒有其他病例報告。本研究對早發性CPP(6歲前乳房發育)的女孩進行分子篩查，以確定可能的改變PROKR2．

方法

我們分析了31例特發性CPP女孩的DNA，這些女孩在刺激後的基礎LH水平>為0.3 IU/L，峰值LH水平>為5iu /LMKRN3突變。采用Fisher精確檢驗比較多態性等位基因頻率與基因組聚集數據庫(gnomAD)中相應等位基因頻率的差異。

結果

沒有發現罕見的變異。發現5個多態性位點(rs6076809、rs8116897、rS3746684、rs3746682、rs3746683)。除rs3746682外，其餘均與文獻報道的等位基因頻率(MAF)較小。rs3746682的MAF高於gnomAD(本研究中為0.84,gnomAD為0.25)。

結論

其他G蛋白偶聯受體(即GPR54)的突變PROKR2似乎不是女孩發生CPP的常見原因。

特發性中樞性性早熟(CPP)是由於下丘腦GnRH分泌過早激活所致，而中樞神經係統無先天性或後天器質性病變。

CPP在女孩中的患病率高於男孩[1］．盡管大約70%的青春期時間變化似乎是由基因引起的，但導致CPP的遺傳機製仍是科學研究的一個領域[2］．到目前為止,MKRN3功能喪失突變是引起CPP最常見的單基因原因[3.，4］．雜合子激活突變KISS1而且KISS1R據報道，基因是少數CPP病例的病因[5，6］．DLK1功能喪失突變決定了一種更複雜、但不常見的表型，其特征為CPP、超重、早發型2型糖尿病、高脂血症和多囊卵巢綜合征[7］．此外，還發現了以臨床症狀或染色體異常為主的罕見的CPP患者[8］．

2017年，Fukami等人通過下一代測序進行了擴展分子分析，並在基因中發現了一個新的雜合移碼突變PROKR2一名3.5歲的女孩受CPP影響[9］．PROKR2是一種表達在GnRH神經元細胞膜上的G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor, GPCR)，其激活可促進GnRH的分泌。該基因的功能缺失突變約占先天性促性腺功能減退症伴或不伴嗅覺喪失的5% [10］．與其他產生終止密碼子的mRNA移碼突變相比，Fukami及其同事發現的突變mRNA p.C242fsX305能夠逃脫無意義介導的mRNA衰變機製。體外實驗表明，該變異受體自身不發揮活性，而在雜合子狀態下增強了野生型受體的活性。其作用的確切機製仍不清楚。也許，過度活躍的突變野生型異二聚體具有更強的配體親和力，或者由於c端結構域的截斷而降低了受體的內在化。

本研究旨在對其進行分子篩選PROKR2一組CPP女孩的變異。考慮到Fukami等人描述的患者異常年輕，我們將分子篩查限製在6歲之前發病的CPP女孩。

到目前為止，沒有其他突變的數據PROKR2在CPP是可用的。

設置

為了探討PROKR2在CPP發病機製中的可能作用，我們建立了一項為期2年的前瞻性、觀察性多中心研究。4個意大利中心參與了這項研究:那不勒斯坎帕尼亞大學“Luigi Vanvitelli”的婦女、兒童、普通和專科外科、那不勒斯費德裏科二世大學的兒科轉化醫學學係、裏雅斯特的“Burlo Garofolo”婦幼保健研究所和博洛尼亞大學的兒科學係。坎帕尼亞大學的倫理委員會“Luigi Vanvitelli”批準了該協議，隨後其他中心的倫理委員會也簽署了該協議。根據《世界醫學協會赫爾辛基宣言》，收集了來自父母的書麵知情同意和所有參與者的口頭同意。

主題

我們招募了31名診斷為CPP的女性患者，她們符合以下標準:6歲前發生腦水腫，體檢時定義為Tanner B期≥2，通過青春期基礎黃體生成素(LH)水平(> 0.3 IU/l)或Gn-RH刺激試驗陽性(peak-LH > 5 IU/mL)和正常的大腦MRI診斷為中樞性下丘腦-垂體-性腺激活。

排除標準包括:可能與綜合征特征、中樞神經係統病理(即與CPP相關的腫瘤或非特異性腦異常)相關的先天性缺陷或異常。所有參與這項研究的患者都是意大利人。所有受試者都是無關的。

協議

所有的女孩都接受了臨床檢查，特別注意的發育參數和分期乳腺發育根據Tanner的分類。采用TW2法對右手及手腕x線片進行骨齡測定。采集外周血標本進行激素劑量和基因分析。

采用化學發光法(LIAISON, Diasorin)測定卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)和LH濃度，檢出限分別為0.06和0.05 U/L，法內和法間CV均小於5%。放射免疫分析法測定血清雌二醇(CisBio International)。血漿雌二醇的分析檢出限和功能檢出限分別為4和8 pg/mL。

對於基礎激素水平不符合CPP診斷標準的患者，給予GnRH刺激試驗。0.1 mg Relefact LH-RH(賽諾菲-安萬特，法蘭克福美因，德國)後的Peak-LH > 5UI/L為陽性。

所有患者均獲得鞍區MRI薄切片、增強掃描，t1加權和T2加權矢狀位、冠狀位序列，3DT2薄切片軸向序列和FLAIR和EPI DWI軸向序列。

基因分析

按照製造商的說明，使用DNA提取試劑盒(Promega, Madison WI, USA)從外周血中提取基因組DNA。每兩個編碼外顯子和內含子-外顯子的邊界PROKR2用兩對引物分別用聚合酶鏈反應(PCR)擴增基因，然後在標準條件下用直接測序(ABI PRISM 3100, Perkin Elmer, USA)進行分析。本研究中使用的引物序列將根據作者的要求提供。為了減少由於其他突變在樣本中可能產生的選擇偏差，我們采用了類似的程序進行篩選MKRN3基因序列分析，以排除目前最常見的CPP的遺傳原因。所有基因分析均在坎帕尼亞大學婦女、兒童、普通和專科外科進行。Vanvitelli”,那不勒斯,意大利。

數據分析

流行病學數據以中位數(四分位數間範圍)表示。Fisher精確檢驗被用來比較我們的多態性等位基因頻率與gnomAD報告的那些。采用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis檢驗比較各單核苷酸多態性(SNP)基因型亞組。結果在a時達到統計學意義p-value小於.05。所有的統計分析均使用Windows上的Stat-Graph Centurion XVII軟件進行。

我們隊列的臨床和實驗室特征見表1．第一次發生裂的中位年齡為5.6歲(最小-最大:1.1-5.9歲)。有性早熟家族史者占26.9%。未發現突變MKRN3整個樣本中的軌跡。

所有患者均接受GnRH類似物(雷公藤relin)治療，反應良好。特別的是，在我們的隊列中，有兩名患者在3歲前出現乳房發育，他們的性早熟進展非常快，生長加速，淚層進展，其中一例子宮出血，都需要阻斷治療。所有這些臨床特征排除了這些患者的選擇性診斷為青春期小。

在編碼區沒有罕見的變異PROKR2被確定。如表所示，我們發現了5個多態性2．除1例患者外，所有患者在不同的組合中都有一個以上的snp。4個snp的MAF與文獻報道的相似2)．SNP rs3746682在MAF中發現了統計學顯著差異:在我們的隊列中為0.84，而gnomAD為0.25 (p值<。)。

對於每個SNP，不同基因型亞組之間青春期開始的中位年齡沒有發現差異(表3.)．

PROKR2在調節嗅球形態發生和性成熟中起重要作用[11］．過度活躍的前運動素係統是性早熟的一個明顯的發病機製。然而，在編碼區未檢測到罕見的序列變異PROKR2在我們的群體。

我們確實意識到我們的樣本量相對較小，但由於選擇的嚴格要求，它是非常同質的:所有患者都有6歲前發病的特發性CPP，且基因分析為陰性MKRN3．這種招募方法排除了7 - 8歲之間的“灰色地帶”，在不需要醫療幹預的情況下，“青春期加速/快速進行性瞳孔縮小”可以發生正常變體。此外，它還建立了一個與索引病例臨床特征最相似的隊列PROKR2Fukama等人報道的突變性青春期早熟。因此，盡管結果是否定的，我們的研究結果仍然很有趣。事實上，我們可以推測如果突變在PROKR2編碼區可以解釋10%的CPP，我們就可以在我們的樣本量內以95%的置信水平和90%的精度鑒定出至少一個突變。因此，我們可以建議PROK2R至少不是CPP的常見原因，即使是在早期發病的CPP。

這些發現表明，對於其他GPCR(如KISS1R) [6]，功能變異的獲得是引起CPP的一個非常罕見的原因，可能是因為這些基因發揮了關鍵作用，這一通路中的高信號幾乎不被耐受。

由於我們隻評估了編碼區和內含子-外顯子關節，我們不能排除這些區域之外可能存在突變。啟動子區域和miRNAs調控元件應該是進一步研究的下一個目標，因為它們也可能在基因表達的轉錄和轉錄後控製中發揮重要作用MKRN3CPP基因教會我們[12］．

我們在我們的隊列中發現了5個不同的snp:其中4個顯示出類似gnomAD的等位基因分布，表明CPP中沒有個體作用。目前的知識和研究結果不足以評估特定的多態性組合是否可能影響基因表達並有助於確定CPP發病。一方麵，我們的隊列和gnomAD之間5個snp中有4個的等位基因頻率分布沒有差異，它們的良性變異特征排除了它們在CPP中的潛在作用。另一方麵，內含子變異的作用尚不完全清楚，可以主張其作用的表觀遺傳機製。由於樣本量小且沒有對照組，目前尚不清楚特定的snp組合是否可能調節CPP的發生。未來需要基於更大隊列的病例對照研究來研究特定的單倍型區段在CPP中的可能作用。

有趣的是，我們觀察到與文獻報道相比，我們隊列中rs3746682多態性的MAF有統計學顯著差異。由於樣本量小，很難區分這種不同的等位基因頻率是否具有臨床意義，還是隻是一個隨機發現。事實上，rs3746682 (p.Thr195=)是一個同義SNP，它可能不會顯示出病理作用。然而，這種變異與日本人對甲基苯丙胺的依賴有關[13]和日本女性的雙相情感障礙[14］．

雖然屬於不同的醫學領域，但這些發現表明，這種特殊的SNP可以調節個體對某些藥物的反應和發展為精神疾病的易感性。由於CPP是一種多因素疾病，我們不能排除rs3746682參與了環境和遺傳背景之間的複雜相互作用。然而，由於缺乏功能研究，這種多態性改變基因表達的分子機製仍不清楚。在更大的隊列和功能研究中研究rs3746682是很有趣的。

此外，重要的是要記住，小鼠對prokineticin係統的研究表明，PROK2-PROKR2信號似乎涉及許多其他下丘腦功能，如調節視交叉上核晝夜時鍾[15］．因此，在更複雜的表型背景下，該基因突變可能導致未分離的CPP。促動力素係統在青春期時間調節中的作用及其在人體內的破壞仍有待進一步研究。

本研究狀態PROKR2基因變異並不是引起CPP的常見原因，在非常年輕的女孩中也是如此。據我們所知，這是第一個提供分子篩選的研究PROKR2在一組特發性CPP患者中CPP的遺傳病因仍然是一個有趣的研究領域，我們的篩選結果支持這樣的觀點，即促性腺功能減退症相關基因的功能獲得突變似乎是引起CPP的一個非常罕見的原因。

在當前的研究中使用和分析的數據集可從通信作者在合理的要求。

CPP:

中央性早熟

GnomAD:

基因聚合數據庫

加:

輕微的等位基因頻率

GPCR:

G Protein-Coupled受體

韓:

Luteinizating激素

FSH:

促卵泡激素

聚合酶鏈反應:

聚合酶鏈反應

SNP:

單核苷酸多態性

PH值:

陰毛鞣製階段

護士:

原始數據

B:

乳房Tanner階段

E2:

雌二醇

不適用。

沒有要申報的東西。

作者和聯係

1. 英國坎帕尼亞大學兒童、婦女、普通和專科外科。Vanvitelli”,那不勒斯,意大利

   Francesca Aiello, Grazia Cirillo, Giuseppina R. Umano, Emanuele Miraglia del Giudice和Anna Grandone

2. 博洛尼亞大學兒科，意大利博洛尼亞

   亞曆山德拉凱西奧

3. 意大利那不勒斯大學兒科-轉化醫學學係

   Raffaella Di激射微波

4. 母親和兒童保健研究所，" Burlo Garofolo "，意大利的裏雅斯特

   蔣祿卡Tornese

貢獻

FA撰寫稿件，GC和GU進行實驗室分析，AC、RD、GT和EM入組患者並進行所有臨床檢查，進行數據分析，撰寫數據解釋，AG設計研究，修改草稿並分析數據。作者閱讀並通過了最終稿。

相應的作者

對應到安娜Grandone．

倫理認可和同意參與

所有研究都遵循《世界醫學協會赫爾辛基宣言》規定的道德標準。該研究得到了“Comitato Etico”AOU Università degli Studi della Campania”L。Vanvitelli”,那不勒斯,意大利。所有患者的父母均提供家長書麵知情同意參與。

同意出版

收集家長的書麵知情同意書以供發表。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有經濟或非經濟上的競爭利益。

出版商的注意

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