在西班牙兒童中，汞的神經毒性與自閉症譜係障礙無關

背景

與自閉症譜係障礙(ASD)發展相關的病理生理病因仍存在爭議。不同的作者研究了神經毒素，如汞(Hg)及其與ADS的關係。這項研究的目的是評估一組ASD兒童(慢性接觸)和尿排泄(急性接觸)中汞的水平，並與健康組進行比較。

方法

對西班牙兒童進行病例對照研究。我們比較了54名沒有其他相關病理的ASD兒童(2-6歲)和正常發育的對照組(54名受試者)。

結果

對照組和ASD組的尿液(p:0.631)和毛發(p:1.000)樣本檢測限以下百分比無差異，ASD回歸亞組(AMR) (p:0.08)和ASD非回歸亞組(ANMR) (p:0.705)也無差異。當分析校正年齡和性別時，汞水平之間的差異保持不顯著。在整個ASD組中(p: 0.739)，或者當他們被細分為ASD- amr組(p: 0.739)和ASD- anmr組(p: 0.363)時，兩者之間沒有相關性。

結論

目前的研究在我們的地理區域內沒有證據支持汞神經毒性與ASD的發病機製之間的聯係。

環境因素參與了自閉症譜係障礙(ASD)的發病機製。然而，重金屬的作用尚未完全確定。其中一種解釋ASD的病因假說認為，神經毒性可能來自重金屬，尤其是汞(Hg)。汞是一種獨特的元素，與許多金屬不同，它對人體沒有必要的生物功能。它在體內的存在是外源性的，主要來自於攝入受汙染的食物，特別是被捕撈或工業化養殖的魚。頭發中汞的含量與飲食接觸(主要是食用魚類)尤其相關[1］．未氧化的汞是高脂溶性的，具有穿越血腦屏障和引起神經元毒性的能力。

兒童比成人更容易受到環境汙染物的影響。它們的排毒機製不成熟，它們的高度脆弱性與體積、營養方麵(兒童每單位體重飲水和進食更多)和行為模式(觸摸嘴的行為)有關[2，3.］．這些假說都提示ASD患兒可能存在代謝和清除重金屬的過程中存在缺陷，從而導致症狀的發生。

雖然血液和尿液分析一直是生物監測的傳統方法，但人類頭發提供了一個有趣的基質，因為金屬化合物的濃度比在血液或尿液樣本中發現時高10倍。血液和尿液的濃度顯示了最近的接觸，頭發水平顯示了過去接觸的累積，提供了生長周期的平均值[4］．因此，毛發檢測可以作為一種生物監測環境中長期暴露於有毒物質的篩選工具。

一些已發表的研究存在顯著的局限性，其結果存在爭議，包括缺乏重複性、樣本量有限、回顧性設計、回憶和發表偏差、病例和對照不充分匹配以及使用非標準工具診斷自閉症譜係障礙[5］．最近的一項係統性綜述提供了證據，表明在不同的發育階段暴露於環境毒素可能會增加ASD的發病風險，環境和遺傳風險因素對ASD的發病有促進作用[5］．一項薈萃分析結果顯示，汞可能是ASD病因學中的一個重要的因果因素。ASD患者的排毒和排泄機製似乎受損，導致汞在體內積聚[6］．頭發中汞濃度的增加和ASD嚴重程度的增加之間也有統計學上的顯著相關性[7］．血液、尿液和頭發的濃度可作為ASD中不同形式汞接觸的結果，用於預測可能的健康影響[8，9，10，11］．因此，本研究的目的是評估原發性或特發性自閉症譜係障礙兒童和同齡健康兒童頭發和尿液中的汞水平。研究中的所有兒童都來自相同的地理區域，具有相似的人口、社會經濟和住房特征，以及環境和家庭暴露。ASD的診斷是由經驗豐富的專業人員在生命的最初幾年做出的，因為這是神經發育的一個非常敏感的階段。

主題

根據DSM-5診斷為ASD的學前兒童(2-6歲)的觀察性病例對照研究。連續選擇患兒並排除其他病理與asd無關、不同年齡範圍或不符合類似環境的患兒。此外，如果兒童服用了汞合金或用螯合劑治療，則不考慮參加研究。

我們選擇ASD患兒評估其頭發和尿液中汞的濃度，並研究其與ASD核心症狀和其他發育參數的可能關係。研究人員將ASD兒童的汞水平與正常發育的對照組兒童的汞水平進行了比較，對照組兒童生活在Córdoba(西班牙)的同一城市地區，他們的家庭經濟和社會狀況與ASD組相似，暴露在類似的環境中。

采用M-CHAT量表(Checklist for Autism in Toddlers, M-CHAT)對所有ASD患兒進行篩選。隨後，獲得了每個孩子的詳細臨床病史。自閉症診斷觀察表第二版(ADOS-2)用於疑似自閉症患者。與此同時，每一個被試都進行了以下測試:12］．廣泛性發育障礙行為量表(PDDBI) [13]、兒童自閉症評定量表(CARS)、巴特爾發展測驗(Battelle Developmental test)和優勢與困難問卷(SDQ)。這些測試讓我們更有把握地診斷自閉症譜係障礙。

本研究中選擇的所有ASD病例均未出現任何其他相關病理(癲癇發作，或其他神經、代謝或遺傳疾病)。對每個患者進行補充性的臨床評估。此外，還對兒童進行了遺傳研究(核型和微陣列)，以檢測繼發性或綜合征性ASD。沒有一個病人需要藥物來治療行為障礙或攻擊性。

考慮到多達三分之一的自閉症譜係障礙(ASD)患者存在神經發育退化，並表現出先前獲得的語言和社交技能的喪失，ASD兒童組被進一步細分為兩個亞組，基於在生命的最初幾年存在神經發育退化(AMR)或不存在神經發育退化(ANMR)。

我們進行了初步的發育臨床訪談(改編自許多資料，包括ADI-R和自閉症家長訪談-臨床版)，以確定ASD和神經發育退化的核心症狀[14］．

對照組由與ASD組相同的人口統計學、環境暴露和家庭特征的兒童組成。根據我們地區的疫苗接種計劃，他們也接種了相同的疫苗。臨床和分析證實這些兒童無疾病。獲得了孩子法定監護人的知情書麵同意。該研究得到了醫院生物醫學倫理委員會的批準，符合1964年《赫爾辛基宣言》規定的倫理標準。

臨床病史

對被選參與調查的兒童的父母或法定監護人進行了幾份問卷調查，以收集有關人口、社會經濟和住房特征的信息，以及環境和家庭接觸、父母的職業史、母親的牙科工作情況，以及懷孕期間是否注射Rho (D)免疫球蛋白等變量。從所有兒童中獲得了詳細的發育臨床病史，包括重大兒童疾病和免疫接種、潛在的環境有毒接觸和飲食失憶。此外，還製定了一份經過標準驗證的問卷，以獲得關於兩組研究對象的食物攝入頻率和飲食習慣的信息。還對孩子進行了全麵的身體檢查，重點是神經係統和營養狀況。采用標準技術進行人體測量(體重、身高、身體質量指數[BMI])。

尿樣

從每個參與者身上收集第一個早晨的尿液樣本，該樣本置於用HNO3(20%)預處理的無菌聚乙烯容器中，並用MilliQ水衝洗兩次。然後，樣品被儲存在−80°C，直到分析。在兒童中進行的主要生物監測研究(如NHANES和GerES研究)使用尿液而不是侵入性樣本，如血液，因為後者很難獲得，會導致低參與率，可能導致選擇偏差[15］．鑒於世界衛生組織指南認為肌酐值小於0.3 g/l或大於3 g/l的尿液樣本不具有代表性，應將其排除在統計分析之外，以盡量減少計算標準化濃度時的高估和低估。

頭發樣本

人類的頭發是從枕骨區域剪下來的。至少需要30毫克的頭發進行分析。用非離子洗滌劑和乙醇溶液對頭發進行超聲波清洗。

汞的測定

對尿液及頭發樣本中金屬化合物測定的分析程序的驗證已在其他地方報告[16］．采用外部標準物質(CRM)對分析方法進行控製。尿液的參考樣本(參考文獻201,205)由Seronorm (Billingstad, Norway)提供，頭發的參考材料NIES No. 5從日本環境廳國家環境研究所獲得。此外，作者還獲得了西班牙勞動部國家衛生研究所(national de Seguridad e Higiene en el Trabajo)提供的尿液中汞的外部質量控製的幫助。采用氫化物發生體係，采用原子吸收-爐法測定汞。用日立917自動分析儀用Jaffe法測定尿肌酐水平。尿液(μg L-1)和毛發(μg g-1)的檢出限分別為0.002和0.0002。尿液(μg L-1)和毛發(μg g-1)的定量限分別為0.007和0.0007。分析的變異係數為3.56% [16］．

統計分析

考慮到ASD組(AMR;ANMR)和對照組。接受α風險為0.05和β風險為0.2的雙側檢驗，每組19名受試者必須承認3 μg-L的Hg水平的最小差異具有統計學意義。假設公共標準差為1.5。預計輟學率為20%。計算幾何平均值和百分位數來描述樣品中的金屬濃度。檢測限(LOD)以下的水平被指定為LOD(分別表示為尿液和頭發樣本的μg L-1肌酐和μg g-1)，並除以2的平方根。

通過Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗(非正態分布)或Student檢驗(正態分布)評估平均汞水平的差異，以及預測變量和潛在混雜因素(性別、年齡、BMI)的潛在影響。分類資料采用卡方檢驗進行分析。尿液和頭發樣品中金屬濃度的相關程度通過Spearman等級相關檢驗評估。單變量和多變量Tobit對數線性回歸模型用於評估與金屬水平相關的變量。Tobit模型的使用允許對效果進行估計，盡管有大量樣本低於LOD。

如Barr等人所推薦[17尿液肌酐水平被作為獨立協變量納入回歸模型，而不是使用肌酐調整的金屬濃度(肌酐標準化)，因為這種方法不容易產生偏差效應估計。采用SPSS 21軟件和State 11統計軟件包進行統計分析。

54例健康兒童和57例ASD患者作為對照。在隨後的訪談中，ASD組有3例患者不符合ASD的臨床標準。因此，他們被排除在研究之外。本研究中所有ASD患兒的ADOS-2檢測均超過ASD診斷分界點。她們和她們的母親都沒有接觸過任何已知的有毒物質。兩個自閉症男孩無法被歸類，因為他在20個月大的時候被國家收養。所有參與研究的兒童都接受了常規的兒童疫苗接種，他們和他們的母親都沒有接觸過任何已知的有毒物質。

ASD患兒和正常對照組的一般特征見表1．對照組和ADS組兒童的年齡範圍相近。我們沒有發現各組之間在體重、身高和身體質量指數(BMI)方麵有任何顯著差異。正如預期的那樣，自閉症譜係障礙患者中男孩的比例更高。此外，我們沒有發現兩組之間在BMI方麵有任何差異。對ASD組進行回歸分類檢驗後，確定19例符合AMR標準，33例符合ANMR標準。關於每周的魚攝入量，對照組和ASD組之間沒有發現差異(表)1)，包括AMR和ANMR亞組(p: 0.273)。

表格2顯示了兩組以及AMR和ANMR亞組頭發和尿液中汞水平的百分比和幾何平均值。ASD對照組和ASD組、AMR組和ANMR組在尿液(p: 0.631)和毛發(p: 1)樣本中低於LOD的百分比無差異(p: 0.08;p: 0.705)。此外，在ASD組中，不同性別的尿液和毛發中汞含量沒有差異(尿液:男性:0.50±0.62 μg/L vs女性:0.76±1.31μg/L;p: 0.990;頭發:男:7.8±9.38μg / g和女:11.23±15.19μg / g;p: 0.685)，與對照組(尿液:男性:0.252±0.34 μg/L vs女性:0.43±0.49μg/L;p: 0.313;頭發:男性11.33±12.19 μg/g，女性15.08±13.23 μg/g;p: 0.990)。 When the analysis was adjusted for age and sex in the multiple log-linear regression study, the Hg differences in urinary levels and hair concentrations were not significant (Table3.)．

在整個ASD組中，頭發中的汞和尿液中的汞濃度之間沒有相關性(p: 0.739;R: 0.033)，或當它們被細分為AMR時(p: 0.739;R: 0.033)和ANMR (p: 0.363;接待員:0.169)。Hg水平與Battelle、ADOS-2、PDDB、CARS、SDQ測試之間存在多重相關性，包括所有這些測試評估的每個區域。在ASD組中，頭發和尿液中的汞含量與所研究的行為臨床評分之間也沒有相關性。

所有的孩子，不管他們屬於哪個組，得分都高於ASD診斷的分界點。在ASD的兩個亞組之間，通過ADOS-2測試評估的各個區域的得分沒有差異(結果未顯示)。在其他基線測試中，AMR亞組的ASD患兒在CARS測試中的得分顯著更高(ANMR: 30.6±6.11 vs AMR: 35.9±8.12;p= 0.009)和自閉症評分(ANMR: 46.13±10.47 vs AMR: 53.39±10.39;p= 0.023)。在巴特爾量表總分上，AMR組得分較低，提示發展較慢(ANMR: 60.96±13.25 vs AMR: 47.05±10.33;p= 0.002)。

在目前的研究中，自閉症兒童頭發和尿液中汞的濃度與正常發育兒童的濃度沒有差異。ASD組和對照組半數以上的尿汞含量低於檢測能力。在頭發中，兩組汞濃度甚至遠低於LOD百分比。此外，我們發現ASD組、AMR和ANMR亞組的頭發和尿液中汞濃度沒有相關性。因此，這些結果表明，ASD兒童的頭發中汞濃度非常低，這表明慢性汞接觸非常低，尿液中汞濃度也很低，表明當前汞接觸非常少。與ANMR組相比，AMR組在CARS、SDQ和PDDBI測試中得分更低，可能是因為AMR組症狀更嚴重，而不是歸因於兩組之間的汞水平。

一些發表的研究在方法上有重要的局限性，結果有爭議。因此，在這項研究中，我們測量了一個對照組和另一個自閉症譜係障礙兒童的頭發和尿液中的汞含量，這些兒童來自我們相同的地理區域，有著非常相似的人口、社會經濟和住房特征，以及相同的環境暴露和家庭生活。在被研究的孩子中，父母的職業曆史相似。免疫接種也是一樣。沒有重金屬的環境毒性暴露。在ASD和正常發育的兒童中，魚類攝入的頻率(地中海飲食模式)和飲食習慣非常相似。ASD的診斷是由經驗豐富的專業人員在兒童生命的最初幾年做出的，因為這是一個非常敏感的發展階段。關於性別，在我們的前瞻性觀察病例對照研究中，ASD的患病率因性別而異，在男性中更為常見1)．我們的結果與其他已發表的研究一致，在這些研究中，男性被診斷為ASD的可能性是女性的四倍[18，19，20.，21］．

沒有重金屬的環境毒性暴露。進食魚類的頻率(地中海飲食模式)和飲食習慣在自閉症譜係障礙和正常發育的兒童中非常相似。

通過使用精確且經過驗證的方法，我們沒有發現高濃度Hg和ASD症狀之間的證據。相反，Blaurock-Busch E等人[11研究人員研究了ASD兒童與對照組兒童接觸汞和其他重金屬的可能環境危險因素和來源。這些作者發現，在平均尿液中汞含量的差異具有統計學意義，而不是在頭發中。Tabatadze T等的病例對照研究[10]評估了ASD兒童樣本中的重金屬濃度，並對60名4至5歲兒童進行了與ASD相關的變化的鑒定。這些作者獲得了Hg濃度與ASD之間的高相關性和顯著值。這些結果還表明，與健康兒童相比，ASD兒童的重金屬汙染程度較高。

另一方麵，Qin YY等[8研究人員將ASD兒童的血漿與健康兒童的血漿進行了比較，結果顯示ASD兒童的汞含量高於健康兒童。海產品中汞含量與海產品含量呈正相關。類似地，Li H等[9]研究了ASD兒童血液中汞和其他重金屬的水平是否與年齡和性別匹配的對照組有顯著差異。這些研究的結果可能支持重金屬暴露(即汞)在ASD症狀的發生中起關鍵作用。然而，應該考慮到，上述作者所進行的研究包括了從地理和人口區域收集的隊列，與本研究中納入的兒童不同，那裏的環境和飲食習慣與這些作者所研究的係列有很大的不同。

方濤等[22]研究了飲食中汞接觸與頭發總汞(THg)之間的關係，該研究在中國東部的一個社區進行，該社區以淡水魚為主，而不是海魚。頭發THg濃度與每周食用魚的平均質量呈正相關，表明魚類消費是該地理區域頭發THg的主要貢獻因素，影響描述結果的差異。此外，有多種假設可以解釋這種病理。事實上，我們課題組最近報道了ASD患者在其他生物學參數上的顯著差異，也觀察到了ASD患者腸道菌群的變化[22，23，24］．

在穀胱甘肽(GSH)的作用下，汞在紅細胞中被氧化，並通過膽汁、尿液和融入毛發由糞便排出。ASD的病因假說中，研究最多的假說之一是重金屬中毒的可能性，尤其是汞中毒。Bernard等[25]基於慢性汞中毒症狀與ASD核心缺陷的相似性，闡述了ASD與Hg毒性相關的假設。在他們方麵，Nelson等人[26]檢查了這兩個變量，並得出結論，ASD中沒有出現汞中毒的一些表現，如共濟失調、視覺障礙、周圍神經病變、高血壓、皮疹和血小板減少。在這方麵，有許多以兒童為基礎的研究試圖澄清重金屬對自閉症譜係障礙發展的影響程度，但不同人群的研究結果相互矛盾，分析了與症狀嚴重程度相關的相關因素[27，28，29］．許多研究在方法論上有很大的局限性，在ASD患兒中，某些遺傳和有毒環境因素可能在神經發育的關鍵階段產生協同影響。盡管自閉症譜係障礙與環境中重金屬暴露之間存在正相關，但這些作者無法就因果關係得出確切的結論[9］．

還應指出的是，汞的安全限度為1 μg/g [30.歐洲兒童的平均水平為1.99 μg/g [31］．一些作者表明ASD與汞毒性之間存在正相關(僅在頭發中測量汞水平)[22，32]與母親在懷孕期間吃魚的數量以及自閉症兒童每周平均吃魚的數量有關。這些研究是在亞洲和非洲的人口中進行的，似乎涉及的海洋和/或河流受到了更多的汙染，或者研究對象食用了大量的魚。關於膳食攝入量的詳細數據主要集中在魚類的種類和通過有效問卷進行量化，尚未提供。在我們的樣本中，我們分析了食物攝入的頻率，特別是與魚的攝入有關，我們觀察到健康兒童和ASD兒童組之間沒有差異，無論是否有神經發育衰退(表)1)．因此，可能有一係列的環境暴露影響這些結果。在本研究中，與來自相同地理和環境區域的健康兒童相比，ASD兒童尿液和頭發中的汞濃度沒有顯著差異。

我們的研究的局限性包括難以從相同的地理區域和共享相似的社會經濟和環境條件收集同質的ASD和健康兒童樣本。通過使用5種特定的測試，避免了ASD診斷中的選擇偏倚，這些測試由合格的專業人員進行確認ASD。樣本的估計與樣本量一致，有足夠的能力檢測差異和相關性。此外，我們進行了回歸分析，調整年齡和性別，以避免這些可能的混淆因素。

在這項觀察性病例對照研究中，研究對象是被診斷為自閉症譜係障礙的西班牙兒童和健康的類似兒童，沒有證據支持頭發和尿液中的汞濃度與我們所在地區的自閉症譜係障礙之間的關係。盡管有這些結果，對環境毒物和ASD的進一步高質量流行病學研究仍有必要澄清發表的研究結果中的爭議。

所使用的數據集可根據合理要求從PNJL獲得。

不適用。

這項研究得到了西班牙兒科學會的研究基金INVEST的支持。資助機構沒有參與數據的設計、收集、分析和解釋，也沒有參與手稿的撰寫。

作者指出

1. Fernando Gil-Hernández和Antonio R. Gómez-Fernández對這項工作做出了同樣的貢獻。

作者和聯係

1. 西班牙格拉納達大學醫學院法律醫學和毒理學學係

   費爾南多Gil-Hernandez

2. 雷納兒科Sofía大學醫院Córdoba，研究所Maimónides de Investigación Biomédica (IMIBIC)， Córdoba，西班牙

   Antonio R. Gómez-Fernández, María Josede la Torre-Aguilar & Juan L. Pérez-Navero

3. 罕見病生物醫學研究中心(CIBERER-ISCIII)，西班牙馬德裏

   胡安·l·Perez-Navero

4. 雷納兒童代謝單元Sofía大學醫院，Instituto Maimónides Investigación Biomédica(IMIBIC)， Córdoba大學，西班牙馬德裏CIBEROBN

   Katherine Flores-Rojas和Mercedes Gil-Campos

5. 雷納心理和兒科精神病學單元Sofía大學醫院，Córdoba，西班牙

   皮拉爾Martin-Borreguero

貢獻

GHF對樣品進行分析，分析數據並起草稿件;GFAR和MBP開展了臨床和心理評估，以及自閉症譜係障礙測試;PNJL, TAMJ設計了這項研究，收集和分析數據;FRK、GCM分析了數據並修訂了工作。所有作者已經閱讀並批準了最終版本的手稿。

相應的作者

對應到胡安·l·Perez-Navero．

倫理認可和同意參與

雷納Sofía大學醫院Córdoba(西班牙)的臨床研究和生物倫理委員會批準了該議定書，符合《赫爾辛基宣言》規定的基本倫理原則。測試前獲得每個參與者的父母或法定監護人的知情書麵同意。

同意出版

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們之間沒有利益衝突。

出版商的注意

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