中國兒童Beckwith-Wiedemann綜合征的臨床和分子特征:一項單中心回顧性隊列研究

背景

貝克威氏綜合征(BWS)是一種具有多種臨床特征和癌症易感性的遺傳性過度生長障礙。在本研究中，我們旨在研究中國BWS患者的臨床特征和分子缺陷。

方法

本研究回顧性招募了2014年1月至2017年12月在上海兒童醫院臨床懷疑BWS的31例患者。提取臨床數據，包括人口統計學、臨床特征和分子檢測結果並進行係統分析。

結果

BWS評分≥4 (6,IQR 4,7)的患兒有21例臨床診斷為BWS, BWS評分≥2 < 4 (2,IQR 2,3)的患兒有10例臨床疑似BWS患者。臨床診斷患者最常見的主要特征是大舌細胞增生(71.4%)，其次是偏側性過度生長(33.3%)和臍外(14.3%)，主要提示特征是臍疝和/或直腸分離(65.0%)和耳皺或耳坑(61.9%)。10例臨床疑似BWS患者中，3例(30%)和2例(20%)出現巨舌細胞增生和偏側性過度生長，7例(70.0%)出現臍疝和/或直腸分離。7例(33.3%)臨床診斷患者和3例(30%)疑似患者在KCNQ1OT1:TSS差異甲基化區(DMR;IC2 LOM)、5例(23.8%)臨床診斷BWS患者H19/IGF2:IG-DMR甲基化增加(IC1 GOM)， 1例(4.8%)臨床診斷BWS患者父係單係異二體11 (pUPD11)。IC2型LOM、IC1型GOM和pUPD11患者的表型-基因型相關性分析無顯著差異。

結論

目前的研究是中國大陸第一個BWS患者隊列研究。這些患者的臨床和分子特征與中國其他報道的BWS患者相似。

Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS, OMIM#130650)最早由Beckwith JB和Wiedemann HR在20世紀60年代報道，是一種罕見的基因過度生長障礙，具有多變的臨床特征和癌症易感性[1，2，3.］．據估計，BWS的發病率為1 / 10,000活產[4］．BWS的臨床表現包括大粘液症、巨大兒、腹壁缺損、半增生、腹部器官腫大、耳部異常、麵部火紅痣、腎輸尿管畸形等。此外，據報道，BWS患者在兒童早期發生胚胎腫瘤的風險增加，如肝母細胞瘤和肝母細胞瘤[1，5］．

BWS主要是由影響染色體11p15.5區域內印跡基因表達的分子改變引起的[1，2］．11p15.5染色體的印跡簇包含兩個印跡域，分別為IGF2/H19和CDKN1C/KCNQ1/KCNQ1OT1，分別由H19相關印跡中心1 (IC1)和KCNQ1OT1相關IC2控製[6］．已有研究表明，在大多數BWS患者中可以觀察到影響染色體11p15區印跡基因的表觀遺傳或遺傳缺陷，而DNA甲基化異常是最常檢測到的分子缺陷[7，8］．H19/IGF2甲基化增益:IG差異甲基化區(DMR;IC1 GOM)， KCNQ1OT1甲基化缺失:TSS (DMR;在已報道的BWS患者中發現IC2 LOM、父係單係異二體(pUPD11)、CDKN1C功能突變丟失以及改變11p15.5拷貝數或結構的染色體異常[4，7，8，9］．

在歐洲和北美的BWS患者中，各種臨床表型和基因型已經得到了很好的描述[1］．然而，中國大陸關於BWS患者的臨床特征和分子病因學的報道還很有限。在本研究中，我們對中國上海地區臨床懷疑BWS患者的臨床特征和遺傳缺陷進行了單中心回顧性研究。

研究群體

2014年1月至2017年12月期間，回顧性招募上海兒童醫院31名臨床懷疑BWS的兒童參加研究。臨床數據包括人口統計學、臨床特征、妊娠相關發現、BWS家族史和分子檢測結果從醫療記錄中提取，並根據最近製定的BWS臨床和分子診斷國際共識聲明進行係統重新評估[1］．經典BWS的臨床診斷標準是基於基本特征和提示特征的BWS評分≥4分的患者。評分製度定義為每個基本特征2分，每個暗示特征1分[1］．本研究符合《赫爾辛基宣言》的要求，並獲得上海兒童醫院倫理審查委員會的批準。所有兒科患者均獲得其父母或法定監護人的書麵知情同意。

分子檢測

使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)從受試者外周血中提取基因組DNA。采用甲基化特異性-多重連接依賴探針擴增(MS-MLPA)方法檢測染色體11p15區IC1 (H19/IGF2: g - dmr)和IC2 (KCNQ1OT1:TSS-DMR)基因的甲基化狀態和拷貝數變化。根據製造商的說明，使用的試劑盒是來自MRC-Holland (Amsterdam, NL)的ME030-C1 BWS/RSS試劑盒。基因組DNA (200 ng)變性，用探針混合物在60°c下雜交16小時。樣品被平均分成兩個等分，分別用連接酶單獨處理或用連接酶和HhaI處理。聚合酶鏈式反應(PCR)進行，並在ABI Dx3500基因分析儀(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上分離產物。用基因掃描軟件分析電泳圖，用Coffalyser version 9.4軟件(MRC-Holland, Amsterdam, NL)計算相對峰麵積。識別序列的雜合子缺失或重複被定義為探針擴增產物的相對峰值高度降低35-50%。GOM和LOM定義為甲基化百分比>分別比正常健康對照高或低20%(甲基化百分比約為50%)[10］．同時有IC1 GOM和IC2 LOM的患者被鑒定為pUPD11 [11］．

數據分析

收集患者的人口統計學、臨床特征、妊娠相關發現、BWS家族史和分子檢測結果進行分析。所有數據輸入定製數據庫，然後用SPSS統計軟件(版本22,IBM, Armonk, NY, USA)進行分析。定量數據彙總為中位數和四分位範圍(IQR 25 - 75)或適當的百分比數字。采用描述性分析方法對患者的一般特征、具體臨床特征及分子缺陷進行分析。采用Fisher精確檢驗(2 × 2或3 × 2矩陣)比較不同基因型組的臨床特征。雙尾p-值≤0.05為有統計學意義。

臨床特征

如表所示1在納入研究的31例臨床懷疑BWS的兒童中，18例為男孩(58.1%)，13例為女孩(41.9%)，入組時的中位年齡為3個月(IQR 2, 6.5)，範圍為1 ~ 72個月。BWS評分≥4 (6,IQR 4,7)的患兒有21例臨床診斷為BWS, BWS評分≥2 < 4 (2,IQR 2,3)的患兒有10例臨床疑似BWS患者。21例臨床診斷的患者最常見的基本特征是大膠質細胞增生(圖2)。1A)，在15例(71.4%)患者中觀察到，隨後出現偏側性過度生長(7/ 21,33.3%;無花果。1B, c)和臍外(3/ 21,14.3%)。1例(4.7%)患者觀察到持續> 1周的高胰島素血症，需要升級治療。最常見的提示性特征是臍疝(圖。1d)和/或直腸分離和耳紋或耳坑(圖。1E)，分別在65.0和61.9%的臨床診斷患者中檢出。在臨床診斷的BWS患者中還觀察到其他提示性特征:麵部單純性痣(11/21,52.3%，圖。1f)，腎大和/或肝大(10/ 21,47.6%)，出生體重> 2 SDS高於平均值(8/ 21,38.1%)，短暫性低血糖(5/ 21,23.8%)，羊水過多(4/ 21,19.0%)。10例臨床疑似BWS患者中，3例(30.0%)出現巨舌細胞增生，2例(20.0%)出現偏側性增生。臨床疑似BWS患者最常見的提出性特征是臍疝和/或直腸分離(7/ 10,70%)，其次是腎腫大和/或肝腫大(2/ 10,20.0%)，出生體重> 2 SDS高於平均值(2/ 10,20.0%)，耳皺痕或凹陷(1/ 10,10.0%)和羊水過多(1/ 10,10.0%)。本隊列入組時未觀察到與bws相關的胚胎腫瘤。1例BWS評分為6分的女性患者通過輔助生殖技術(ART)受孕。

Beckwith-Wiedemann綜合征具有代表性的主要和提示特征:一個巨舌症(患者3號);b，c偏側性過度生長(7號患者);d臍疝(1號患者);e耳皺(13號患者);（f)麵部單純性痣(患者23號)。這些圖像的發布已獲得父母的書麵知情同意

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分子的缺陷

所有31例臨床懷疑BWS的患者均進行MS-MLPA檢測。共10例(7例臨床診斷，3例疑似)診斷為IC2型LOM, 5例臨床診斷為BWS患者診斷為IC1型GOM(表2)2)．1例4歲男童同時患有IC1 GOM和IC2 LOM，經鑒定為pUPD11(圖1)。2)．經ART受孕的女性患者被鑒定為IC2 LOM。MS-MLPA未觀察到IC1和IC2的拷貝數變化。臨床特征與基因型的相關分析顯示，IC2型LOM、IC1型GOM和pUPD11患者除偏側性過度生長外，其餘患者的臨床特征與基因型無顯著差異(表2)3.)．最後，根據BWS評分≥4和/或檢測到的分子缺陷，共24例患者被確診為BWS。

病例號19的MS-MLPA檢測結果顯示H19/IGF2:IG差異甲基化區(DMR;IC1 GOM)和KCNQ1OT1甲基化損失:TSS-DMR (IC2 LOM) (一個，b)和健康對照(c，d）

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歐洲和北美BWS患者的臨床特征和分子病因學在文獻中已經得到了很好的研究。盡管BWS的典型臨床表現為大膠質細胞增生、巨大兒、腹壁缺損和胚胎腫瘤風險增加，但越來越多的證據表明，並不是所有BWS患者都表現出所有這些表型特征[1］．越來越多缺乏基本特征的BWS患者被鑒定為11p15.5區域的分子缺陷[12，13］．因此，臨床特征和分子檢測對BWS的臨床診斷和治療都很重要。

在目前的研究中，我們進行了一項單中心回顧性隊列研究，以表征中國上海一家三級兒童護理中心臨床疑似BWS患者的臨床特征和分子缺陷。我們發現，在我們的隊列中，臨床診斷的BWS患者中最常見的基本特征和提示特征是大舌細胞增生(71.4%)和偏側性過度生長(33.3%)，臍疝和/或直腸分離(65.0%)和耳皺或耳坑(61.9%)，這與之前兩項關於中國人群BWS的研究相似[14，15］．一項研究[14]的研究結果顯示，臨床診斷的患者最常見的主要臨床特征是腹壁缺損、大膠質細胞增生和產前或產後過度生長，最常見的小特征是耳皺或耳坑和麵部火焰痣[14］．一項大專範圍的回顧性研究[15]在香港進行，27例經分子證實的BWS報告最常見的臨床特征是巨大兒和大粘液症(70.4%)和腹壁缺損(70.4%)。由於BWS患者具有廣泛的臨床特征，最近的一項研究調查了不同種族/民族人群的BWS患者的臨床表現是否不同[9］．研究表明，歐洲/北美人群的BWS患者中大舌塊症和臍外肌的發生率高於亞洲人群，而歐洲/北美人群中臍疝、器官腫大和側化過度生長的發生率低於亞洲人群[9］．在我們研究的隊列中，臨床診斷BWS患者的主要臨床特征發生率與之前報道的亞洲BWS患者相當[9］．盡管據報道BWS患者在兒童早期發生胚胎腫瘤的風險增加[1，5]，該隊列中未觀察到bws相關的胚胎腫瘤。此外，據報道，抗逆轉錄病毒治療是BWS的風險因素[16]，在我們的研究中，一位BWS評分為6分的女性患者通過ART受孕。

迄今為止，中國大陸僅報告了少數經基因證實的BWS病例。2013年，我們在中國上海報道了兩例經表觀遺傳學證實的BWS病例:一名女性患者為IC2 LOM，一名男性患者為IC1 GOM [17］．王強等報道了中國深圳兩例由染色體11p15.5的父源性複製引起的BWS病例，其中1例是通過臍帶血產前分析診斷的[18］．研究表明，在大多數具有已知分子缺陷的BWS患者中，染色體11p15區域的IC2 LOM(50-60%)和IC1 GOM(5-10%)發生[5］．采用MS-MLPA檢測本研究中所有臨床懷疑BWS患者的染色體11p15區IC2和IC1基因的甲基化狀態。其中7例臨床診斷為IC2 LOM, 3例疑似BWS, 5例臨床診斷為IC1 GOM, 1例臨床診斷為BWS。在我們研究的隊列中，與之前報道的歐洲/北美和亞洲BWS患者相比，IC2 LOM發生率較低，IC1 GOM發生率較高[9]，這可能是由於研究隊列的規模較小。結果顯示，50%的臨床診斷BWS患者被鑒定為IC2 LOM, 4%的IC1 GOM在台灣BWS患者中被鑒定為[14］．此外，對香港華人BWS患者的分子研究顯示，48.1%的BWS病例是由IC2 LOM引起的，11.1%是由IC1 GOM引起的[15］．ART受孕的女性患者被鑒定為IC2 LOM，這與既往研究一致[15，19］．在以往對中國BWS患者的研究中也觀察到CDKN1C突變和pUPD11 [14，15］．不幸的是，在最初的基因檢測中，該隊列未進行CDKN1C功能缺失突變檢測，患者的父母在隨訪過程中拒絕進行進一步的基因檢測。然而，在我們未來的工作中，將CDKN1C突變檢測納入BWS兒童的分子病因研究是很重要的。

本研究存在一些局限性。首先，本報告描述了一項單中心回顧性研究，研究對象數量有限。其次，沒有進行微衛星分析來進一步確認MS-MLPA識別的pUPD11病例。第三，本研究隊列中未進行CDKN1C功能突變丟失檢測。在今後的工作中，將CDKN1C突變檢測和微衛星分析納入中國BWS兒童的基因型特征研究中具有重要意義。

我們的研究首次描述了中國大陸31例臨床懷疑BWS患者的臨床特征和分子缺陷。由於中國人口眾多，報道的病例有限，需要進一步研究中國人群與其他研究人群之間的臨床特征和遺傳機製的差異。

支持本稿件結論的原始數據將由作者提供，沒有任何不適當的保留給任何合格的研究人員。

受虐婦女綜合症:

貝威二氏綜合症

集成電路:

印記中心

MS-MLPA:

甲基化特異性多重結紮依賴探針擴增

差:

四分位範圍

IGF2:

胰島素樣生長因子2

藝術:

輔助生殖技術

pUPD:

父親的單親的isodisomy

SDS:

標準偏差的分數

作者感謝該家庭的參與和支持這項研究。

國家自然科學基金項目(資助號81870373、81500449)、上海市自然科學基金項目(資助號16ZR1428700)、上海市醫院發展中心新前沿技術聯合研究項目(資助號SHDC12017115)、上海市衛計委重點項目(資助號2017ZZ02019)資助。資助方在研究設計、數據收集和分析、出版決定或稿件準備方麵沒有任何作用。

作者和聯係

1. 上海交通大學附屬上海兒童醫院消化、肝髒與營養科，上海200062

   王瑞雪，肖詠梅，李丹，胡輝，李小璐，葛婷，餘榮華，王毅中，張婷

貢獻

YW和TZ設計了這項研究。RW和YW起草了手稿。RW, YX, HH, XL, TG, RY和DL采集，分析和解釋數據。YW和TZ編輯了手稿。所有作者同意對所有方麵的工作負責。作者(們)閱讀並批準了最終稿。

相應的作者

對應到譯王或Ting張．

倫理批準和同意參與

本研究的基因研究和發表都獲得了患者父母的書麵知情同意。該研究由上海兒童醫院區域倫理審查委員會批準。

同意出版

所有作者都已閱讀並批準了該內容，並同意提交該內容以供考慮在期刊上發表。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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