首次報道的多態性MTRR, GATA4, VEGF和ISL1巴基斯坦兒童孤立性室間隔缺損(VSD)基因

背景

室間隔缺損(VSDs)是指分隔心髒心室的室間隔畸形。VSDs可表現為單一異常(隔離/ nonsyndromicVSD)或作為一組表型的一部分(綜合征房間隔缺損)。缺陷的確切位置對於將缺陷與潛在的遺傳原因聯係起來至關重要。到心髒外科就診的兒童人數不斷增加。然而，關於巴基斯坦兒童的VSDs遺傳沒有代表性的數據。

方法

從拉合爾的兒科心髒單位招募了242名受試者(121名VSD兒童和121名健康對照)。收集受試者的臨床和人口學資料。一共四個snp，每個都來自MTRR, GATA4，VEGF,ISL1采用PCR-RFLP法進行基因分型。

結果

結果表明，小等位基因(T)頻率(MAFs)對黃曲黴病有顯著影響MTRR基因變異rs1532268 (c.524C > T)在對照組和病例中分別為0.20和0.41，基因型頻率在對照組中分別為3、35、62%，在TT、CT、CC基因型中分別為12、59、29%(等位基因OR: 5.73, CI: 3.82 ~ 8.61)。p -取值範圍:5.11 × 10⁻⁷)．為GATA4變異rs104894073 (c.886G > A)，對照組和病例的MAF分別為0.16和0.37,AA、GA和GG基因型的頻率分別為2、28和70%，病例的頻率分別為5、64和31%(等位基因OR: 3.08, CI: 2.00-4.74;p-value: 8.36 × 10⁻⁸)．的rs699947 (c.-2578C > A)VEGF對照組和病例的MAF分別為0.36和0.53，對照組的基因型頻率為13、42和45%，AA、CA、CC的基因型頻率為22、15和63%(等位基因OR: 2.03, CI: 1.41 ~ 2.92，p值:0.0001)。的ISL1基因變異rs6867206 (g.51356860 T > C)，對照組和病例的MAFs分別為0.26和0.31。TT、TC、CC三種基因型的基因型頻率分別為48、52、0%和39、61、0%(等位基因OR: 0.27, CI: 0.85 ~ 1.89，p值:0.227)。的MTRR，GATA4而且VEGF變異顯示了相關性ISL1在招募的隊列中，變異似乎與VSD無關。

結論

巴基斯坦兒童的第一份報告表明，編碼轉錄因子、信號分子和參與胎兒心髒發育的結構性心髒基因的單核苷酸多態性與發育性心髒缺陷有關。，但需要進一步的工作來驗證目前的調查結果。

先天性心髒缺陷(CHDs)是指在胎兒發育期間，由於心髒發育異常而引起的心血管畸形[1］．在全球範圍內，估計冠心病患病率約為8-10/1000活產。在所有冠心病中，室間隔缺損(VSD)的患病率最高(1.5-3.5‰活產)。VSDs占所有冠心病的25-35%。亞洲的冠心病(9.3/1000活產)及VSDs(2.62/1000活產)患病率最高[2］．在巴基斯坦，30%的冠心病患者有室間隔缺損[3.］．如果心髒心室之間的壁沒有完全發育，在室間隔上留下一個洞，就會出現室間隔性心動過速[4］．這種畸形可表現為單一異常(稱為孤立性室間隔缺損)，可合並心內病變，也可合並更為複雜的異常，如法洛四聯症(TOF)、雙右心室出口等。5］．

單核苷酸多態性導致的同型半胱氨酸通路酶的失調在VSD的發生中起著重要作用。以往的研究表明，孕期補充葉酸對胚胎發育缺陷有保護作用。的MTRR該基因編碼了參與葉酸代謝/同型半胱氨酸途徑的蛋氨酸合酶還原酶(MSR)。編碼這種酶的基因突變會導致高同型半胱氨酸血症，這是心髒病的危險因素。MTRR多態性，如rs1532268 (c.524C > T)被認為是VSD發展的危險因素[6，7］．

許多轉錄因子(如NKX2.5, GATA4, TBX5)和信號通路分子參與正常心髒發育[8］．GATA係列(GATA1-6)包括鋅指轉錄因子，它們通過與DNA序列GATA上的啟動子結合來調節各自基因的轉錄。GATA4是胚胎心髒形成過程中高度表達的轉錄因子[9］．2003年，基因突變GATA4基因可導致VSD表型[10］．染色體位置GATA4基因為8p23.1，長度3371 bp，由6個外顯子組成[11］．大量研究表明GATA4基因3外顯子rs104894073 (c.886G > A)與VSD有關[12］．該變體降低了GATA4轉錄因子與DNA結合的親和力，導致其轉錄活性降低[13］．

血管內皮生長因子(VEGF)是一種血管生成調節劑和參與血管形成的信號蛋白。它在心髒的發育中也起著重要的作用。VEGF異常在VSD的發病機製中起重要作用。研究表明，SNP rs699947 (c.-2578C > A)位於該基因中VEGF啟動子與孤立性VSD風險增加有關[14］．

ISLET1(由ISL1基因)在心髒形態發生中也起重要作用。ISL1存在於染色體5q11.1上，編碼一個控製次級心場分化的轉錄因子。ISL1祖細胞產生近三分之二的心髒細胞。SNP rs6867206 (g.51356860 T > C)被認為與冠心病相關[15］．

目前研究的目的是從巴基斯坦孤立性室間隔缺損(VSD)兒童患者和年齡/性別匹配的對照組中招募樣本(血液/頰拭子)，並調查所選擇的snp 1)。MTRR；NM_002454;rs1532268;c.524C > T;p.Ser175Leu, 2)GATA4；NM_001308093;rs104894073;c.886G > A;p.Gly296Ser, 3)VEGF；NM_003377;rs699947;c.- 257c > A, 4)ISL1；rs6867206;基因間;g.51356860 T > C在招募隊列中。

研究對象

從巴基斯坦拉合爾Ittefaq醫院和兒童醫院心內科病房收集了121例分離的VSD患者(72名男性和49名女性)的血液/口腔拭子樣本。對照血液樣本121份(男性99份，女性22份)，來自不同醫院的無心髒缺陷兒童。15歲以下轉介到三級轉診中心的新兒童也包括在這項研究中。獲得患者或監護人的書麵知情同意，目前的研究得到了機構倫理委員會的批準。

入選標準

超聲心動圖診斷。采用二維超聲心動圖和多普勒超聲心動圖鑒別缺損的大小、數量、確切位置及分流的大小。采用改進的伯努利方程估計肺動脈壓。主動脈瓣脫垂和主動脈瓣反流也被注意到。通過左心室舒張末期和收縮期尺寸、多普勒血流速度測量和反流射流的長度、寬度和麵積等參數評估主動脈瓣反流的嚴重程度。所有超聲心動圖均由訓練有素的兒科心髒病專家進行。有VSD伴其他心外或心外症狀(綜合征性VSD)的樣本和任何血清陽性樣本(HBV/HCV/HIV)的病例和對照組均被排除在研究之外。

參數和危險因素的數據收集

收集年齡、家族史、近親婚姻、懷孕期間母親血紅蛋白水平、懷孕期間抗生素使用等數據，以及其他血液學參數，如白細胞計數、紅細胞計數、血紅蛋白水平、血小板計數、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SC)、鈣、鈉、鉀、膽紅素、血清穀丙轉氨酶、血清穀草乙酸轉氨酶、堿性磷酸鹽、測定血清白蛋白、γ - GT等。

基因分型

采集血液/頰拭子樣本，並在−20°C保存。采用鹽析法從人白細胞/上皮細胞中分離基因組DNA。用0.9%瓊脂糖凝膠分析基因組DNA質量。用於擴增的引物序列MTRR，GATA4，VEGF而且ISL1基因多態性、各自的限製性內切酶和消化片段長度見補充表1．針對各遺傳標記優化PCR反應條件和RFLP消解混合物。PCR和RFLP產物在1.5/2%瓊脂糖凝膠上進行。

統計分析

使用社會科學統計軟件包(SPSS version 22, IBM statistics)進行統計分析。計算各參數的均值和標準差。病例和對照組的基因型頻率通過χ 2 (χ 2)計算²)，而等位基因頻率則通過直接計數來計算。基因型和等位基因頻率以計數和百分比的形式報告。通過Shapiro-Wilk檢驗檢驗各定量變量的正態性。對研究人群進行Hardy-Weinberg平衡測試。由於包含4個SNPs, Bonferoni進行了調整p0.0125作為所有分析的顯著性閾值。

病例平均年齡(月)為20±3.2，(男性平均年齡20.8±4.1，女性平均年齡19.8±5.5,1 ~ 169個月)。6%的患者兄弟姐妹患有室間隔缺損，18%的患者一級親屬患有心髒病。67%的患者的父母是堂兄妹。血液學參數的描述性特征已在其他地方描述[16］．

如果是rs1532268 (c.524C > T)的變體MTRRTT、CT和CC基因型分別為12、59和29%，對照組分別為3、35和62%。病例間T和C的等位基因頻率分別為0.41和0.59，對照組為0.20和0.80。顯性和隱性模型的基因型分布見表1(占主導地位;或:0.25,ci: 0.15-0.43，p-value: 2.4 × 10⁻⁷，隱性:OR: 5.15 CI: 1.44-18.40，p-value: 0.005，等位基因OR: 5.73, CI: 3.82-8.61，p-value: 5.11 × 10⁻⁷)．基因型頻率均處於Hardy-Weinberg平衡(p值:0.07)。

對於GATA4的rs104894073 (c.886G > A)變體，AA、GA和GG基因型在病例中的比例分別為5、64和31%，而在對照組中為2、28和70%。病例間A和G的等位基因頻率分別為0.37和0.63，對照組為0.16和0.84 (OR: 3.08, CI: 2.00-4.74，p-value: 8.36 × 10⁻⁸)．在主導模型中，OR為0.19,CI為0.11-0.32p-value 6.7 × 10⁻¹⁰而在隱性模型中，OR為3.0,CI為0.61 ~ 15.70p值0.15。對照組的基因型頻率處於Hardy-Weinberg平衡(p值:0.49)。

基因型為rs699947 (c.-2578C > A)VEGFAA、CA和CC基因型的比例分別為22、15和63%，對照組為13、42和45%。病例間A和C的等位基因頻率分別為0.36和0.64，對照組間等位基因頻率分別為0.54和0.47(等位基因OR: 2.03, CI: 1.41 ~ 2.92，p值:0.0001)。顯性和隱性模型的基因型分布見表1(占主導地位;或:0.25,ci: 0.13-0.46，p-value: 4.7 × 10⁻⁶，隱性:OR: 1.80 CI: 0.90-3.55，p值:0.089)。對照組的基因型頻率處於Hardy-Weinberg平衡(p值:0.886)。

為ISL1變異rs6867206 (g.51356860 T > C)， CC、TC和TT基因型的比例分別為0、61和39%，對照組為0、52和48%。病例間C和T等位基因的等位頻率分別為0.31和0.69，對照組間的等位頻率分別為0.26和0.74(等位OR: 0.27, CI: 0.85-1.89，p值:0.227)。在優勢模型中，OR為0.71,CI為0.43-1.19p-value 0.194，而由於病例和對照組均無純合隱性基因型，無法進行隱性模型的建立(表2 - 4)1)．隊列的基因型頻率偏離Hardy-Weinberg平衡(p值:0.0001)。

目前的研究旨在對參與心髒發育不同階段的基因變異進行基因分型。這對發展中國家尤其重要，因為發展中國家治療發育性心髒缺陷的費用很高，許多家庭無法負擔矯形手術的費用。在全球範圍內，治療鼻中隔缺陷的技術進步已經導致壽命從短短幾年增加到成年。支持遺傳原因對於設計高危家庭的產前篩查和遺傳谘詢具有重要意義。亞洲人群獨特的遺傳結構是遺傳學家研究大量遺傳疾病的遺傳標記的夢想;然而，這付出的代價是近親群體中遺傳疾病的高流行率。

對於rs1532268 (c.524C > T)的變體MTRR基因中，C、T等位基因頻率存在差異，且差異有統計學意義。這一結果與之前的一項研究一致[6),MTRR基因變異rs1532268 (c.524C > T)已被報道為伊朗受試者VSD發展的潛在危險因素。由於同型半胱氨酸代謝在心髒發育中非常重要，病例組中風險基因型比例較高表明可能對心髒發育有影響。

GATA轉錄因子家族控製著許多組織類型的生長，GATA4是心髒胚胎發生過程中高表達的轉錄因子。的GATA4基因突變可導致心髒形成過程信號的改變。如果rs104894073 (c.886G > A)的變體GATA4GG基因型在對照組(70%)中比在對照組(31%)中更為普遍。AA基因型的頻率在病例中(5%)比對照組(2%)更普遍。以往的研究[17未能發現兩者之間的任何關聯GATA4基因變異rs104894073 (c.886G > A)與VSD。這種變異很罕見，以前報道過它的頻率很低。最初的調查報告表明，這種變異在家族性VSD病例中發現了它，但在對照組中沒有發現[18］．在當前隊列中觀察到的這種變異的相對較高的頻率可以歸因於種族差異或樣本偏差。

準確的脈管係統的形成是形成最終心髒結構和腔室的關鍵因素。這一過程的改變可能導致心髒畸形，包括結構缺陷。許多生長調節劑對血管係統有很大的影響，其中一個重要的是水泡內皮生長因子(VEGF)。編碼這種蛋白質的基因變異會導致一係列後果。所選rs699947 (c.-2578C > A)的變體VEGF基因中C、a等位基因頻率與對照組差異有統計學意義。病例隊列中風險等位基因的較高頻率可能是由於對心髒發育的潛在影響。雖然這些效應不顯示因果關係，但它們在建立低-中等效應量變量與結果之間的關聯方麵很重要。

對於rs6867206 (g.51356860 T > C)的變體ISL1基因，我們無法檢測到變異和結果之間的任何聯係。病例和對照組均無純合多態性基因型。顯性和等位基因模型也沒有證明該變異與VSD之間的任何關係。在病例和對照組之間，次要等位基因頻率略有不同，並且在招募隊列中，這種變異似乎不是影響心髒發育的適度效應大小變異。

我們描述了基因分型的結果，多態性MTRR，GATA4，VEGF而且ISL1孤立性室間隔缺損的巴基斯坦兒童的基因。這是一個獨特的群體，近親婚姻加上宗教、社會和文化階層在一些遺傳疾病的發展中發揮了重要作用。這項研究的局限性是樣本量相對較小，包含的遺傳標記數量有限，樣本僅來自巴基斯坦的一個省。盡管有這些局限性，目前的報告代表了第一次初步嚐試的結果，以確定遺傳基礎的腦室間隔缺陷的巴基斯坦兒童。

所有必要的信息已隨手稿一起提供，但是，任何與本文相關的信息，可以聯係相應的作者。

房間隔缺損:

室間隔缺損

MTRR:

5-甲基四氫葉酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶還原酶

VEGF:

血管內皮生長因子

ISL1:

ISLET1

冠心病:

先天性心髒缺陷

SPSS:

社會科學統計資料包

作者感謝所有患者及其家屬對本研究的寶貴參與。倫敦大學學院心血管科學研究所的Ann Walker教授，Petros Syrris博士和Andrew Cook教授在手稿修改方麵給予了他們的幫助。

旁遮普大學為這項研究提供了資金支持。

作者及隸屬關係

1. 旁遮普省大學微生物學與分子遺傳學研究所，拉合爾，54590，巴基斯坦

   Sumbal Sarwar, Farah Ehsan, Shabana, Amna Tahir, Mahrukh Jamil, Saleem Ullah Shahid和Shahida Hasnain

2. Ittefaq信托醫院，拉合爾，巴基斯坦

   Asim汗

貢獻

Shabana, SH和AK構思研究概念，FE, SS, AT和MJ進行台架工作，SUS和Shabana分析結果並起草手稿，Shabana嚴格審查手稿並監督研究。作者閱讀並批準最終的手稿。

相應的作者

對應到Shabana．

倫理批準並同意參與

該研究得到了機構倫理委員會(巴基斯坦旁遮普省大學生物科學學院倫理委員會)的批準，所有程序都符合赫爾辛基宣言。所有受試者或父母/監護人(15歲以下兒童)均獲得書麵知情同意。

發表同意書

這篇文章的發表不存在利益衝突。

相互競爭的利益

作者宣稱他們之間沒有利益衝突。

出版商的注意

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