雙等位基因CNTNAP2變異男孩的多動刻板運動

背景

雜合變異體在CNTNAP2涉及到廣泛的神經表型，包括智力障礙(ID)、癲癇、自閉症譜係障礙(ASD)和語言障礙。然而，雜合子變異也可在未受影響的個體中發現。BiallelicCNTNAP2變異較為罕見，並會導致一種明確定義的遺傳綜合征，即CASPR2缺乏症，這種疾病的特征是ID、早發型難治性癲癇、語言障礙和自閉症特征。

病例報告

一個7歲的男孩呈現出多動的刻板運動，開始於早期嬰兒，並持續到童年。異常運動包括有節奏的、重複的四肢抖動，具有明顯的刻板特征。其他臨床特征包括ID、注意缺陷多動障礙(ADHD)、ASD和言語障礙，與CASPR2缺乏症一致。全基因組陣列比較基因組雜交檢測到一個母係遺傳的0.402 Mb重複，涉及到基因的內含子1、外顯子2和內含子2CNTNAP2(c.97 + _209——? dup)。內含子1的受影響區域包含一個轉錄因子FOXP2的結合位點，可能導致異常CNTNAP2表達調控。的編碼區Sanger測序CNTNAP2還發現了一個父係遺傳的錯義變體c.2752C > T, p.(Leu918Phe)。

結論

該病例擴展了CASPR2缺乏症的分子和表型譜係，提示多動刻板運動可能是這種複雜神經障礙的罕見但重要的臨床特征。此外，幀內的識別，主要是非編碼重複CNTNAP2指出了一種複雜的潛在分子機製，可能涉及FOXP2結合受損。

BiallelicCNTNAP2CASPR2缺乏症(CDD)是一種綜合征性神經發育障礙，涉及難治性癲癇、ID、語言障礙和自閉症特征[1，2，3.，4］．雜合變異體在CNTNAP2也可在具有廣泛複雜神經表型的患者中發現，但這種變異也可在未受影響的個體中發現[5，6］．

CASPR2，蛋白產物CNTNAP2，是一種來自neurexin家族的跨膜細胞粘附分子，在整個大腦中廣泛表達[5，7］．CASPR2定位於有髓鞘軸突的近端，參與神經元-神經膠質的相互作用，並通過與接觸蛋白2(也稱為TAG-1)的相互作用介導鉀通道的聚集[8，9］．CASPR2也被定位在突觸上，在那裏它參與了一些額外的過程，如神經元遷移、神經突發育和突觸成熟、穩定性和功能[10，11，12，13，14］．

我們描述了一個病人攜帶複合雜合子變異CNTNAP2包括一個錯義變異和一個基因內複製分別從父親和母親那裏繼承的。除了CASPR2缺乏症的共同特征(ID、ADHD、ASD和言語障礙)外，該男孩還表現出特殊的多動刻板運動，擴展了CDD的分子和表型譜係。

本病例為一7歲男童，無神經發育障礙家族史，足月出生，父母非近親健康。1A)雙胎妊娠並發宮內生長受限和子癇前期。他的異卵雙胞胎兄弟出生時健康，但在嬰兒期被診斷為缺位癲癇。新生兒病程的特點是喂養困難導致無法茁壯成長。在3個月大時，觀察到反複哭鬧伴有半連續的、重複的上肢和下肢抽搐運動，被診斷為多動刻板運動(補充視頻)1)．

報告患者的基因發現。（一個)患者攜帶複合雜合子變異的家族譜係CNTNAP2: 17外顯子父係遺傳的錯義c.2752C > T, p.(Leu918Phe) (ENST00000361727.3)和母係遺傳的c.97 +?_209-?Dup在內含子1中重複(確切的斷點還沒有被映射)。（B) Sanger測序痕跡顯示先證者和他父親的雜合子單核苷酸變異，包括亮氨酸到苯丙氨酸的替換。（C)外顯子2複製的確認。基因組DNA的RT-qPCR顯示，與父親相比，患者及其母親有一個額外的外顯子2拷貝。重複斷點位於2外顯子之後，因為2內含子的第一個~ 200 bp仍是重複的。每個條件進行3次技術重複。（D)遺傳突變定位於CNTNAP2．母係遺傳的複製始於第一個內含子，並與轉錄因子FOXP2的結合位點重疊。從陣列- cgh和pcr可以確定複製的大致邊界(參見支持材料)，表明複製也涉及2外顯子和2內含子的一部分。父係遺傳的突變位於第17外顯子。（E的預測結果CNTNAP2蛋白質水平的變異。外顯子2編碼discoidin結構域的第一部分，該序列被母係遺傳的c.97 + _209-?dup變體。父係遺傳的p.(Leu918Phe)變異導致編碼CASPR2第三層聯蛋白G結構域的第17外顯子的氨基酸變化。這兩個結構域都屬於CASPR2的胞外區域，促進了蛋白質之間的相互作用。補充數據包含關於方法和結果的額外細節。Discoidin = Discoidin同源結構域，Laminin G = Laminin G結構域，EGF = EGF樣結構域，FBG =纖維蛋白原樣區域，TM =跨膜結構域，4.1 1b =蛋白4.1結合結構域，PDZ = PDZ相互作用結構域

全尺寸圖像

這些發作性運動亢進-運動障礙發作無任何誘因周期性複發，持續10-12小時，模仿嬰兒絞痛。當使用抗反流配方和雷尼替丁治療合並的複發性嘔吐時，他們的頻率可暫時降低。腦電圖和腦磁共振成像不明顯。

在他生命的最初幾年裏，他表現出多動症和自閉症的特征。該男孩還具有語音處理缺陷和笨拙的粗動作和精細動作也被觀察到。他的神經心理評估(WPPSI-III在6歲時進行)顯示，他的整體智商為71(語言智商為86;性能,68;處理,55)。在隨後的幾年裏，運動障礙通過非觸發的快速、高振幅、有節奏、連續和重複的抖動持續存在，涉及具有刻板特征的四肢(補充視頻)2- - - - - -3.)．他的刻板運動障礙以前曾被誤診為抽搐，實際上在6-7歲時就會出現[15］．然而，這些重複的動作在3歲之前就已經開始了，而且包含了比抽搐持續時間更長、比抽搐更多的劇烈運動模式。幾種藥物，包括卡馬西平、丙戊酸、加巴噴丁、左旋多巴、氟桂利嗪、苯二氮卓，並沒有改善他的症狀。該男孩目前正在服用氯硝西泮，0.2毫克/公斤，每天兩次。

基因的發現

獲得患者父母的書麵知情同意。全基因組陣列- cgh對該四人家族的外周血基因組DNA進行分析，結果顯示該四人家族為母係遺傳CNTNAP2變體c.97 + _209 - ?先證者。Real-time定量PCR證實，該0.402 Mbp的重複存在於內含子1和外顯子2的部分區域，且在內含子2內存在一個斷點(圖2)。1C).該複製不會在CASPR2蛋白中引入移碼。這種複製不會被兄弟繼承。

PCR擴增和Sanger測序進行篩選CNTNAP2在先證者中發現了父係遺傳的錯義變體c.2752C > T, p.(Leu918Phe)。1B). gnomAD數據集沒有這個變體(https://gnomad.broadinstitute.org/variant/)，並影響層粘連蛋白G-like (LG) 3結構域內的保守殘基(GERP = 5.49)。ClinVar(等位基因ID 924741，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation/949154/)和在矽工具(例如，DANN, 0.9977;突變品酒師,1;CADD, 24.1)。這兩種變異在先證者的兄弟姐妹中都不存在。更多細節請參閱補充的方法．

在具有雙等位基因的病人中發現的一係列臨床症狀CNTNAP2變異被統稱為CASPR2缺乏症。運動障礙不包括在這種情況的典型神經係統表現中[1，2，3.，4］．在該患者中，我們觀察到多動刻板運動，包括連續、重複和有節奏的四肢抖動，這在出生後的頭幾個月變得明顯，並持續數年。這些異常運動不像廣泛性肌張力障礙、陣發性非運動性運動障礙或陣發性運動性運動障礙，而是CASPR2缺乏症的一種新的神經表現。這種運動障礙表型可能與CASPR2促進神經傳導和突觸連接的作用有關，特別是考慮到其在中樞和周圍神經係統的廣泛表達[5，9，14］．在患者中存在雙等位變異CNTNAP2，顱腦MRI可能正常，如本例，或顯示皮質發育不良(皮質發育不良局灶性癲癇綜合征，CDFES)。^{1 - 3}其他發現包括小腦異常(蚓類發育不全或萎縮)和非特異性白質異常。^1，2

c.97 + _209 - ?dup和p.(Leu918Phe)變異遺傳自未受影響的雙親，支持雜合子的不完全外顯率CNTNAP2變異(5，6］．母係遺傳變異(c.97 + _209-?dup)包含完全複製的外顯子2 (99 bp)(圖2)。1D)，可能會對蛋白質折疊和/或蛋白質-蛋白質相互作用產生負麵影響。事實上，外顯子2編碼部分盤狀蛋白同源結構域，該同源結構域位於CASPR2細胞外部分，已知介導蛋白-蛋白相互作用，這表明該機製在患者中可能受到幹擾(圖2)。1父係遺傳的錯義變體p.(Leu918Phe)也在CASPR2的細胞外部分，但在第三個LG結構域發現(圖。1E). CASPR2細胞外部分的錯義變異已被證明會損害與接觸蛋白2的相互作用，並影響皮質神經元軸突的生長[12］．這種效應可能與CASPR2和contactin 2相互作用形成的神經元跨突觸橋有關，後者有助於突觸組織和突觸傳遞[16］．因此，確定在該患者中發現的變異是否對蛋白-蛋白相互作用、突觸或結旁組織和信號傳導有功能影響是有價值的。這樣的功能研究可以解釋為什麼是雜合子CNTNAP2變異顯示不完全外顯率，以及為什麼雙等位基因突變一起產生一係列表型，包括本文描述的新型運動表型。

母性複製也有可能改變調控CNTNAP2．轉錄因子FOXP2的靶點是基因的內含子1上的一個結合位點CNTNAP2並調節其表達。突變FOXP2基因是導致兒童語言失用的單基因原因(SPCH1, OMIM #602081) [17),CNTNAP2作為FOXP2靶基因下遊網絡的一部分，在這種疾病的病因中起著重要的作用[18］．這是由基因關聯支持的CNTNAP2特殊語言障礙兒童語音記憶表現的變異[18］．母係遺傳等位基因內含子1中FOXP2目標位點的複製可能會改變FOXP2介導的基因調控CNTNAP2並導致CASPR2水平異常，這一假設需要在細胞或動物模型中進行功能測試。通過這種方式，內含子複製可能有助於神經發育或與FOXP2和CNTNAP2相關的患者的言語表型，如語音處理。

這項研究有兩個主要的局限性。首先，對兩者進行適當的功能表征CNTNAP2無法通過變異來評估它們對蛋白質結構和功能的影響。其次，通過下一代測序(NGS)技術，如全外顯子組測序(WES)或全基因組測序(WGS)，不可能進一步研究是否存在對臨床表型具有潛在修飾作用的額外變異。

這是一個男孩與多動刻板運動和雙等位基因CNTNAP2突變擴大了我們的知識CNTNAP2有關的疾病。它提出了一種新的，罕見的神經係統表現的CDD，並提出了一個顯著的分子機製，其中編碼和非編碼CNTNAP2突變可能會導致觀察到的表型。因此，我們建議進行篩查CNTNAP2在cdd提示表型的患者中，即使是單個雜合子的調控區域CNTNAP2變異已確定或非典型神經表型也存在。這將導致更好的診斷，從而改善對這些疾病患者的管理。這項研究，連同對已確定的突變後果的功能研究，將推進我們對疾病基因的科學理解CNTNAP2．

在研究過程中產生或分析的所有數據都包含在本文發表的文章中。

多動症:

注意力缺陷多動障礙

自閉症譜係障礙:

自閉症譜係障礙

CDD:

CASPR2缺乏症

ID:

智力障礙

門店:

新一代測序

韋斯:

全外顯子組測序

WGS:

全基因組測序

我們感謝患者及其父母的友好合作和對本研究發表的同意。

SCV得到了馬克斯·普朗克研究小組的支持，該小組獲得了馬克斯·普朗克Gesellschaft、人類前沿科學計劃(RGP0058/2016)和UKRI未來領袖獎學金(MR/T021985/1)。文學碩士由國際馬克斯·普朗克研究學院(IMPRS)博士獎學金資助，該學院來自馬克斯·普朗克心理語言學研究所。

1. 馬塞洛·斯卡拉(Marcello Scala)和邁達斯·阿尼斯(Midas Anijs)對這項工作做出了同樣的貢獻。

作者和聯係

1. 小兒神經病學和肌肉疾病科，IRCCS Istituto Giannina Gaslini，熱那亞，意大利

   馬塞洛·斯卡拉，卡洛·米內蒂和帕斯誇裏·斯特裏亞諾

2. 熱那亞大學神經科學、康複、眼科、遺傳學、婦幼保健學係，意大利熱那亞

   斯卡拉、斯庫迭裏、米內蒂和斯特裏亞諾

3. 荷蘭，奈梅亨，馬克斯·普朗克心理語言學研究所，聲音交流組的神經遺傳學

   邁達斯·阿尼斯和索尼婭·c·凡爾納斯

4. 比薩大學臨床與實驗醫學係，比薩，意大利

   羅伯塔Battini

5. IRCCS基金會，Stella Maris，比薩，意大利

   羅伯塔Battini

6. 意大利熱那亞，醫學遺傳中心，加斯裏尼研究所

   Francesca Madia, Valeria Capra, Paolo Scudieri和Federico Zara

7. 意大利佩魯賈大學兒科

   阿爾貝托Verrotti

8. 英國法夫聖安德魯斯大學生物學院

   索尼婭·c·凡爾納

9. 唐德斯大腦，認知和行為研究所，奈梅亨，荷蘭

   索尼婭·c·凡爾納

貢獻

MS, MA, SCV和PS構思和設計了這項研究。MS, RB, FM, VC, PS對該病例進行了臨床回顧並提供了臨床資料。MA和SCV設計並開展分子研究。MS、MA、SCV、PS、AV、FZ和CM對數據進行分析和解釋。MS和MA起草了手稿。SCV和PS負責監督和編輯稿件。所有作者閱讀，嚴格修改，並批準最終稿。

相應的作者

對應到索尼婭·c·凡爾納或Pasquale Striano．

倫理認可和同意參與

患者父母提供了外顯子組測序的知情同意書，並將其納入了由Giannina Gaslini兒童研究所倫理委員會批準的研究研究中。

同意出版

我們已經從患者及其父母處獲得了一份簽署的同意書。

相互競爭的利益

所有作者聲明沒有披露與手稿相關的信息。

出版商的注意

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