複合雜合突變p.Q6X/p的突變分析。H232R在SRD5A2導致46,XY性發育障礙

背景

超過100個突變SRD5A2基因在46,XY性發育障礙(DSD)受試者中已被鑒定。探索SRD5A2突變及其背後的分子機製的闡明將揭示5α-還原酶2酶結構域的功能，並確定46,XY DSD的原因。在此之前，我們報道了一個新的複合物雜合子p.Q6X/p。H232R突變SRD5A246,XY型DSD 1例。該化合物是否雜合子p.Q6X/p。H232R突變in this gene causes 46,XY DSD requires further exploration.

方法

對2例46,XY型DSD病例進行了鑒定和測序。為了確定複合物雜合子p.Q6X/p的來源。H232R突變，the parents, maternal grandparents, and maternal uncle were sequenced. Since p.Q6X mutation is a nonsense mutation, p.H232R mutation was transfected into HEK293 cells and dihydrotestosterone (DHT) production were analyzed by liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) for 5α-reductase 2 enzyme activities test. Apparent michaelis constant (Km) were measured of p.H232R mutation to analyze the binding ability change of 5α-reductase 2 enzyme with testosterone (T) or NADPH.

結果

序列結果表明，2例46,XY型DSD為複合雜合子p.Q6X/p。H232R突變，of which the heterozygous p.Q6X mutation originating from maternal family and heterozygous p.H232R mutation originating from the paternal family. The function analysis confirmed that p.H232R variant decreased the DHT production by LC–MS test. The Km analysis demonstrated that p.H232R mutation affected the binding ofSRD5A2與T或NADPH結合。

結論

我們的研究結果證實了複合物雜合子p.Q6X/p。H232R突變SRD5A2基因是導致46,XY DSD的原因。p.H232R突變降低了DHT的生成，同時降低了5α-還原酶2的催化效率。

46,XY性發育障礙(DSD)的特征是性腺發育不完全和具有正常46,XY核型的個體的女性或模糊表型[1］．46,XY型DSD的主要臨床表型為雙側睾丸和女性外生殖器隱伏，但無子宮和卵巢[2，3.，4］．46,XY DSD受試者的預測發病率高達1:20 000。在受感染的病例中，尿道下裂和隱睾的發病率可達1:200 ~ 1:300 [5，6］．引起46,XY型DSD的病因很多，常見的原因包括雄激素不敏感綜合征(AIS) [7，8，9甾體5α-還原酶2型缺乏症[10，11］．AIS是一種x連鎖隱性遺傳疾病，由雄激素受體功能障礙引起[3.］．5α-還原酶2型缺乏症是由5α-還原酶2型功能下降或喪失引起的常染色體隱性遺傳病[12］．

5α-還原酶2型，由SRD5A2基因，主要表達於附睾、精囊、前列腺和生殖器皮膚[13］．5α-還原酶2型的功能是轉化負責男性性發育的Tto - DHT [14，15］．5α-還原酶2型功能的喪失導致正常向外生殖器、尿道和前列腺分化的失敗，導致5α-還原酶2型缺陷。到目前為止，已有超過100個突變SRD5A2基因已被鑒定[16］．

最近，我們發現了一個複合雜合突變(p.H232R/p.Q6X)SRD5A2來自同一個家族的兩個病例被診斷為46,XY型DSD [17］．DNA測序結果顯示，該基因為p.H232R雜合子突變SRD5A2該基因起源於家族的父係側和雜合子的p.Q6X突變SRD5A2基因源於母係。為了闡明p.H232R突變體對5α-還原酶2型酶活性的影響，我們用p.H232R突變體轉染HEK293細胞。LC-MS表明該突變明顯降低了DHT的產量，表明該突變降低了催化效率。因此，我們的研究結果證實了複合雜合突變(p.Q6X/p.H232R)是46,XY DSD的原因，並且p.H232R突變降低了5α-還原酶2型酶的催化效率。

46,XY型DSD患者的臨床表型

病例1 (III-1):我們之前報道了一例2歲女性，診斷為46,XY型DSD。臨床檢查顯示該先證者有正常的女性外生殖器，但有一個盲端陰道。超聲檢查顯示，她的左側陰唇和右側腹股溝有睾丸，但沒有子宮或卵巢(圖。1a).核型分析顯示先證者為46,XY核型，染色體數量和結構無明顯異常(圖1)。1b).先證者的促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)和T水平低於正常男性(< 0.1 ng/ml)(表2)1)．對先證者的家庭成員也進行了檢查，並生成了譜係。該家族有兩名成員被診斷為46,XY型DSD(圖。1c).測序結果顯示，病例1(III-1)具有46,XY DSD，是先前報道的無義突變p.Q6X (c.16C > T)的複合雜合子(圖)。1d) (17和一個新奇的誤解SRD5A2突變p.H232R (c.695A > G)1e)。

病例2 (III-2):孕21周和孕25周時，病例1的母親來我院做b超檢查。結果顯示，胎兒沒有男性外生殖器(圖。2a).細胞遺傳學分析顯示，患兒的核型為46,XY，染色體數量和結構無明顯異常(圖1)。2b).對染色體13/16/18/21/22/X/Y進行FISH檢測結果顯示，患兒的X和Y染色體正常(圖1)。2c).這些結果表明胎兒的DSD為46,XY。考慮到胎兒出生後可能麵臨無法治療的困難，母親決定終止妊娠。根據外觀，我們發現胎兒的外生殖器不是一個正常的男性生殖器(圖1)。2d).然而，通過外生殖器的組織病理學檢查，發現附睾和睾丸組織(圖。2e).測序分析，病例2 (III-2)也存在無義SRD5A2突變p.Q6X(無花果。2F)和小說的誤解SRD5A2突變p.H232R(無花果。2g)。

遺傳分析確定了SRD5A2突變

尋找其家族來源SRD5A2基因突變後，對病例家族中的6名成員進行了Sanger測序。測序結果顯示，患者的父親II-1和妹妹III-3均無基因突變SRD5A2突變p.Q6X，而他們的母親II-2有(圖。3.a).患者的父親II-1和妹妹III-3患有糖尿病SRD5A2突變p.H232R，但它們的母親II-2沒有突變(圖2)。3.b).這些結果表明46例，XY型DSD患者的錯義突變p.Q6X來自於家庭的母係，而新一代DSD患者的錯義突變p.Q6X來源於家庭的母係SRD5A2突變p.H232R來自父係。

進一步尋找p. q6x /p突變的來源。對病例的姑父II-3、祖父I-1和祖母I-2進行H232R、Sanger測序。不出所料，母舅II-3和祖父I-1均存在無義突變p.Q6X(圖1)。4a)，但沒有新突變p.H232R(圖。4b).病例的祖母既沒有p.Q6X突變(圖。4a)也沒有發生p.H232R突變(圖。4b).這些結果證實了無稽之談SRD5A2突變p.Q6X起源於病例的外祖父譜係。

譜係分析清楚地表明SRD5A2突變表現為常染色體隱性遺傳。無論是小說SRD5A2突變p.H232R或無義突變p.Q6X單獨導致46,XY DSD的發生，但兩者的共發生導致了這種情況。

p.H232R突變降低了5α-還原酶2型酶的催化效率

研究p.H232R基因突變對黑曲黴編碼酶活性的影響SRD5A2基因，我們轉染野生型SRD5A2, p.H232R突變SRD5A2，或控製pcDNA3.1-GFP質粒進入HEK293細胞。DNA測序證實轉染p.H232R突變體的細胞中存在p.H232R突變體SRD5A2(無花果。5a). qPCR和western blot證實為野生型或p.H232R突變體SRD5A2轉染調節的SRD5A2HEK293細胞的表達(圖;5b, c). LC-MS分析顯示，p.H232R基因突變SRD5A2基因與不同濃度睾酮培養時，DHT產量明顯降低。(無花果。5d).使用GraphPad Prism 8.0軟件，得到了Km為12.5 μM，酶催化反應的最大速度(Vm)為1843 nmol DHT/mg蛋白/h，催化效率(Vmax/Km)為147.4 nmol DHT/mg蛋白/h/(μmol/L)。相比之下，轉染表達野生型質粒載體的細胞SRD5A2Km為9.3 μM, Vmax為3352 nmol DHT/mg蛋白/h，催化效率(Vmax/Km)為360.4 nmol DHT/mg蛋白/h/(μmol/L)。這些結果表明，p.H232R突變影響了結合SRD5A2此外，隨著NADPH濃度的變化，LC-MS分析證實，p.H232R突變降低了5α-還原酶2的催化活性(圖1)。5e).使用GraphPad Prism 8.0軟件，我們發現p.H232R突變酶的Km為11.3 μM, Vm為18038 nmol DHT/mg蛋白/h，催化效率為1596.3 nmol DHT/mg蛋白/h/(μmol/L)。相反，在野生型中SRD5A2酶活性Km為1.5 μM, Vm為11077 nmol DHT/mg蛋白/h，催化效率為7384.67 nmol DHT/mg蛋白/h/(μmol/L)。這些結果表明，p.H232R突變影響了蛋白的結合SRD5A2用NADPH。我們的突變研究表明，p.H232R突變通過破壞5α-還原酶2的結合，降低了酶活性SRD5A2與T或NADPH結合。

保護的分析SRD5A2在人類和其他物種中

我們使用MEGA軟件分析殘基的守恒6(圖6)。6a)和232(圖。6B)(用紅框標出的)SRD5A2基因。H232氨基酸在人類、小鼠、大鼠、牛、線蟲、斑馬魚、雞、獼猴、黑猩猩、爪蛙等不同物種中高度保守。這表明H232氨基酸在生物體中很重要，該位點的突變對基因表達有重要影響。

在矽片預測人類致病性方麵SRD5A2p.H232R突變

由於發現的突變p.H232R是一種新突變，其致病性未知，我們首先利用軟件對其致病性進行了預測。采用三種常用的矽油預測軟件工具對矽油對人體的影響進行了預測SRD5A2p.H232R變體:Polyphen2 [18得分為1,SIFT [19得分為0.007，而prove [20.的分數為−7.330。這些分數表明人類SRD5A2p.H232R突變極有可能具有致病性(詳見表)2)．

在這項研究中，我們首先發現一個家庭中的兩個46,XY DSD患者有一種化合物SRD5A2突變(p.H232R / p.Q6X) (17］．對這個家族的進一步測序表明這部小說SRD5A2p.H232R突變或無意義的p.Q6X突變不會導致46,XY DSD的發生。LC-MS顯示，新突變(p.H232R)明顯降低了DHT的產生和表達SRD5A2催化效率。

突變SRD5A2基因是引起46,XY DSD的常見遺傳缺陷，包括點突變、缺失和插入[21］．SRD5A2將T轉化為DHT的函數[22］．在發育早期，DHT負責男性外生殖器、尿道和前列腺的形成[23，24］．基因中的一些突變SRD5A2導致5α-還原酶-2缺乏綜合征的基因[12］．在一名泰國男性假兩性畸形患者中，測序顯示複合突變p. q6x /p。G203S在SRD5A2基因(25］．此外，在一名患有尿道下裂的中國患者中，測序發現了複合突變p.G203S/p。Q6X在SRD5A2基因(26］．在我們的研究中，2例46,XY型DSD病例具有複合雜合子SRD5A2突變p.H232R / p.Q6X。結果表明，雜合子SRD5A2突變(p.H232R)或雜合子SRD5A2單獨突變(p.Q6X)不會引起46,XY DSD。我們和其他人的研究都支持該化合物雜合性SRD5A2突變(p.H232R/p.Q6X)導致46,XY DSD。

的SRD5A2基因位於染色體2p23.1上，編碼一個含有254個氨基酸的蛋白質，包含5個外顯子和4個內含子[24］．p。q6x突變SRD5A2該基因由於缺少T-和nadph結合結構域而導致酶活性完全喪失，從而產生了一種急劇截斷的蛋白質[26，27］．組氨酸232位於三個組氨酸(230-232殘基)的延伸中SRD5A2酶。H230P突變SRD5A2蛋白質使其酶活性失活[28，29］．同時，H231R突變SRD5A2蛋白質會損害同工酶的活性，因為突變主要影響酶結合T [29，30.］．因此，我們推測H232R突變在SRD5A2蛋白質也可能失活或損害SRD5A2酶活性。結合之前的工作和我們的發現，該化合物雜合子SRD5A2變異p.H232R / p。Q6X可抑製DHT的形成，引起46,XY DSD。

大多數識別SRD5A2突變可降低DHT水平，導致5α-還原酶缺乏，這是一種常染色體隱性遺傳病[31，32］．p.H232R突變，位於第4外顯子SRD5A2，位於T結合區域，很可能影響5α-還原酶2與T的結合，使前者活性降低。事實上，據報道p.H231R突變發生在基因的4號外顯子上SRD5A2基因通過與T結合受損相關的機製導致46,XY DSD [30.］．由於氨基酸230、231和232位於外顯子4，涉及組氨酸到脯氨酸或精氨酸的相同突變，突變的影響可能是相似的，都阻止了酶與底物或輔酶的結合[28，29］．我們對酶活性的分析SRD5A2p.H232R突變表明，Vmax/Km值低於WTSRD5A2並減少了SRD5A2這表明p.H232R突變有助於生殖模糊的發展。

我們的研究強烈表明，該化合物雜合子SRD5A2變異p.H232R / p。Q6X導致46、XY的DSD和顯示的效果SRD5A2p.H232R突變在SRD5A2催化效率。建立46,XY型DSD小鼠模型需要進一步研究SRD5A2p.H232R突變，複製46,XY DSD病表型，研究p.H232R在體內對類固醇5α-還原酶2活性的調控機製。

病人

病例1,2歲女童，46歲，XY DSD，於我院就診。對女性外生殖器進行體格檢查。b超檢查男性或女性的內部生殖器官，包括睾丸、子宮和卵巢。此外，進行了激素測定和核型分析，以及219個dsd相關基因的測序。

病例2，病例1的弟弟，在孕25周時疑似46,XY DSD。B型超聲檢查，核型分析，還有SRD5A246,XY DSD進行基因測序。胎兒流產後，行女性外生殖器體檢，睾丸組織和附睾組織HE染色。

基因研究取得家屬書麵知情同意，所有分析均經邢台市人民醫院醫學倫理委員會批準。

激素化驗

用放射免疫法測定病例1 (III-1)血清FSH、LH、雌二醇(E2)、黃體酮(PROG)、T和催乳素(PRL)水平。

核型分析

先得者外周血細胞在添加100 U/ml青黴素、100µg/ml鏈黴素、10%胎牛血清(FBS)的rmi -1640培養基中培養72 h，加入20 μg/ml秋水仙堿(20 μg/ml)培養2 h，以阻滯細胞中期並抑製梭形體形成。樣品在75 mM氯化鉀中孵卵20分鍾，使紡錘體展開並固定在Carnoy溶液中。將固定細胞置於載玻片上，置於75°C的培養箱中風幹3 h。用Giemsa溶液對染色體g帶進行染色。

魚的分析

病例1 (III-1)流產同胞的未培養羊水細胞用於FISH分析。探針用於檢測染色體13、16、18、21、22、X和Y。

基因分析

取病例1、其流產兄弟姐妹、幸存兄弟姐妹、父親、母親、母舅、祖父、祖母的外周血樣本進行DNA測序。根據製造商的說明，使用TIANamp血液DNA試劑盒(Tiangen)提取基因組DNA。病例1 (III-1)的dsd相關基因中219個由華大基因使用Illumina基因組分析儀IIx進行測序(補充表)1)．對病例1(III-1)及其親屬的突變基因進行Sanger測序。通過使用BWA工具將該病例的測序結果與UCSC參考基因組進行比較，確定了突變。

人類SRD5A2定點誘變

人類SRD5A2cDNA由廈門大學韓嘉淮教授提供，亞克隆到載體pcDNA3.1 (3Flag標簽，購自Life Technologies)。產生695A > G突變SRD5A2基因,pcDNA3.1 -SRD5A2質粒作為模板和QuikChange II位點定向突變試劑盒(目錄#200,523;根據製造商的說明，使用安捷倫(Agilent)生產突變位點。克隆695A > G突變的引物SRD5A2基因序列如下:SRD5A2 mF-695: gccttcaccaccgtaggttctacctcaagatgtttg, SRD5A2 mR-695: catcttgaggtagaacctaCggtggtgaaaagctcgcag。

轉染試驗

HEK293細胞(購自中國科學院上海細胞庫)在添加10%胎牛血清(Gibco)和1%鏈黴素/青黴素(Gibco)的杜爾貝科改良鷹培養基中培養。用2.0 μg野生型或p.H232R突變體瞬時轉染細胞SRD5A2根據製造商的協議，使用TurboFect™轉染試劑(Thermo Scientific)在六孔板的每孔中檢測質粒。轉染後的HEK293細胞在5% CO中培養₂測定前在37°C放置48小時。

轉染質粒的DNA測序

HEK293細胞轉染野生型或p.H232R突變體SRD5A2質粒轉染48小時，用Sanger測序評估DNA序列。簡單地說，DNA樣本用TIANamp基因組DNA試劑盒(Cat# DP304-02;TIANGEN,中國)。DNA的濃度和純度用NanoDrop(在260/280 nm, ND2000C;熱)。DNA樣本采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，由中國蘇州Genewiz公司測序。PCR引物序列為:SRD5A2-Fseq: AGCCCGTTAAGCAGTTGAGG, SRD5A2-Rseq: CGGCTTCTTCCGCTTCTTGA。

定量實時聚合酶鏈反應

定量實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測轉染野生型或p.H232R突變體後的mRNA表達情況SRD5A2總RNA用RNAiso Plus (Cat# 9109;TaKaRa)，使用PrimeScript™RT Reagent Kit (RR047A;Takara)，按照製造商的協議。qPCR使用PrimeScript™RT Reagent Kit (RR037A;Takara)和ViiA7實時PCR係統(ABI)。PCR流程如下:95°C 30 s, 95°C 5 s, 60°C 34 s，循環40次。的相對量化SRD5A2信使rna, 2^−ΔΔCt方法執行。qPCR引物序列為:SRD5A2F: GCCACTTTGGTCGCCCTT, SRD5A2R: CTCCGTGTGCTTCCCGTAG， β- actif: AGAGCTACGAGCTGCCTGAC， β-actinR: agcactgttggcgtacg。

免疫印跡

如前所述進行Western blot [33］．簡單地說，在HEK293細胞轉染野生型或p.H232R突變體後SRD5A2質粒培養48 h後，從六孔板中收集，用RIPA緩衝液(P0013;Beyotime生物技術)。全蛋白裂解物經12% SDS-PAGE分離後轉移到硝化纖維素膜上。用5%的牛奶阻斷後，用一級抗體單克隆抗標記(F9291;β-actin (sc-69879;聖誕老人)在4°C的溫度下過夜。用含有1% Tween-20 (TBST)的tris緩衝鹽水衝洗後，用適當的hrp結合二抗(sc516102;用ECL Plus試劑盒檢測(P1050;Applygen)。

動力學分析

通過動力學分析來評估p.H232R變體對5α-還原酶2與睾酮或NADPH結合的影響。轉染對照載體GFP的HEK293細胞，SRD5A2或SRD5A2pH232R用含500 μM NADPH的新鮮培養基培養(CAS: 100929-71-3, N302057;不同濃度的T (0.25 ~ 8.0 μmol/L, CAS: 58-18-4, M163044;阿拉丁)。或轉染對照載體GFP的HEK293細胞，SRD5A2或SRD5A2pH232R用500 μl含10 μM T的新鮮培養基和不同濃度的NADPH (0.0625-2 mM/L)培養。孵育4 h後，收集培養基。用氯仿提取，用冷凍幹燥裝置濃縮，再溶於色譜甲醇進行lc - ms分析，使用含有1 mM甲酸酯(F112034;以及含有100%甲醇的緩衝液B。根據標準DHT的濃度和峰麵積[CDCT-C10255010;安培爾實驗室技術(上海)有限公司用BCA法測定蛋白濃度(P0012S;Beyotime)。計算酶產率(nmol/mg蛋白/h)作為酶活性的指標。數據采用Prism8 (GraphPad)軟件進行處理。 The experiments on each group were repeated three times. The data are presented as mean ± SEM.

序列比對的SRD5A2在人類和其他物種中

FASTA格式SRD5A2從NCBI數據庫中下載同源種序列。蛋白質序列SRD5A2用MEGA軟件將人類和其他同源物種進行比對。

人的致病性分析SRD5A2p.H232R突變

利用以下生物信息學程序分析了人類SRD5A2 p.H232R突變的致病性:polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/),篩選(http://sift.jcvi.org)和proven (http://provean.jcvi.org/seq_submit.php)．

支持本研究結果的數據可向通訊作者索取。

DSD:

性發育障礙

DHT:

二氫睾酮

師:

睾酮

質:

液相色譜-光譜法

公裏:

明顯的米氏常數

AIS:

雄激素不敏感綜合征

FSH:

促卵泡激素

韓:

促黃體激素

虛擬機:

酶催化反應的最大速度

E2:

雌二醇

食物:

黃體酮

光杆載荷:

催乳激素

我們感謝參與這項研究的家屬和醫務人員。

本研究得到國家自然科學基金(No. 81860516)、貴州省衛生健康委科技基金(gzwjkj2019-1-036)、貴州醫科大學國家自然科學基金培養項目(20NSP025)和邢台市科技局(No. 2020ZC343)資助。

作者指出

1. 李利偉和張俊宏對這項工作貢獻相同。

從屬關係

1. 中國邢台市人民醫院檢驗科

   李立偉，李樹軍，郝世瑞，李樹平

2. 貴陽，貴州醫科大學附屬醫院病理科

   Junhong張

3. 貴陽，貴州醫科大學附屬醫院骨科

   清麗

4. 貴陽，貴州醫科大學附屬醫院臨床研究中心

   喬莉，崔毅，吳彤倩，胡平生，竇曉偉，楊輝

5. 中國人民解放軍總醫院第八醫療中心燒傷整形外科，北京

   Pengcheng李

6. 邢台市人民醫院超聲科

   劉麗麗，尹建民

貢獻

李lw、張建宏、李強、喬磊、李pc、崔勇、李sj、郝sr、吳tq、劉ll、尹建明、胡ps進行分子遺傳學研究，參與序列比對並撰寫稿件。SP Li和XW Dou進行了免疫分析。H Yang參與序列比對。XW Dou和H Yang設計了這項研究。所有作者閱讀並批準了最終稿件。

相應的作者

對應到小竇，不要說李或回族楊．

倫理批準和同意參與

實驗獲得邢台市人民醫院醫學倫理委員會批準。獲得父母/監護人同意。

同意出版

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明沒有競爭的經濟利益。

出版商的注意

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再版和權限