社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素與高移動性群箱蛋白1-toll樣受體-髓樣分化因子88信號通路的關係研究肺炎支原體肺炎

背景

近年來，耐火材料報道較多肺炎支原體肺炎(RMPP)逐漸增加，包括關於這些情況如何威脅兒童生命的報告。但是，具體的機理肺炎支原體肺炎(MPP)仍不清楚。本研究旨在探討MPP中社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(CARDS TX)與高遷移群盒蛋白1- toll樣受體-髓樣分化因子88 (HMGB1-TLRs-MyD88)之間的關係，並探討其免疫發病機製肺炎支原體感染。

方法

診斷為MPP並經支氣管鏡檢查的兒童被納入MPP組。同期因支氣管異物行支氣管鏡檢查的患兒為對照組。real-time逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中CARDS TX、HMGB1、toll樣受體2 (TLR2)、toll樣受體4 (TLR4)、MyD88和CD14基因的表達。分析卡片TX與HMGB1-TLRs-MyD88之間的相關性。

結果

MPP組BALF中card TX、HMGB1、TLR2、MyD88和CD14 mRNA表達量均顯著高於對照組(均高於對照組)P< 0.05)。CARDS的TX mRNA表達與HMGB1、TLR2、MyD88、CD14 mRNA表達呈正相關P< 0.05)。HMGB1 mRNA表達與TLR2、MyD88、CD14 mRNA表達呈正相關P< 0.05)。

結論

CARDS TX可能通過HMGB1-TLRs/CD14-MyD88通路參與MPP的免疫發病機製。

社區獲得性肺炎是世界範圍內兒童住院的主要疾病之一，在發展中國家尤其如此。在5歲以上的兒童中，社區獲得性肺炎由以下疾病引起肺炎支原體40%兒童感染(MP) [1］．近年來，難治性病例增多肺炎支原體肺炎(RMPP)已大幅增加[2］．有研究表明，社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(CARDS TX)是MP產生的一種重要毒素[3.］．高遷移率組框蛋白1 (High-mobility group box protein 1, HMGB1)在RMPP中高表達，提示其可能在MP發病中起重要作用[4］．

本研究旨在檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中card TX、HMGB1及其相關受體的相對基因表達。本研究還探討了CARDS TX與HMGB1、toll樣受體(TLRs)、髓係分化因子88 (MyD88)之間的關係，並進一步探討MP的發病機製。

病人

2018年1月至2019年6月，蘇州大學附屬兒童醫院共確診MPP患兒66例，經支氣管鏡檢查。這些兒童被納入MPP病例組(平均±SD年齡，5.58±2.67歲;32個男孩，34個女孩)。同期因支氣管異物行支氣管鏡檢查的患兒20例為對照組(平均±SD年齡，5.23±2.24歲;12個男孩，8個女孩)。

MPP診斷依據如下:(1)符合兒童社區獲得性肺炎診斷標準[5];(2)符合支氣管鏡檢查的適應症[6]:門診或住院治療5 ~ 7天後，臨床症狀、體征和/或影像學複查無明顯改善，需要支氣管鏡檢查和肺泡灌洗的兒童;(3) MP DNA > 1.0 × 10^3.在BALF中檢測到拷貝。

符合以下條件的患兒納入對照組:(1)有明確的異物吸入史及刺激性咳嗽，病程短於7天;(2)影像學檢查示明顯異物影，但未見炎性改變;(3) 2個月內無肺部感染史。

本研究的排除標準如下。其他病毒和細菌感染被排除在外。此外，支氣管肺發育不良、肺腫塊、遺傳和代謝性疾病、血液病和免疫缺陷病史和數據不完整的患者被排除在外。

該研究得到了醫院倫理委員會的批準，並獲得了兒童父母的知情同意。

肺炎患兒BALF的收集

所有患兒術前禁食，不喝水。患兒置於仰臥位，局部麻醉後行支氣管鏡檢查及支氣管肺泡灌洗。根據影像學檢查結果，先檢查健康側，確定是否有炎症和異常。檢查病變部位，37℃生理鹽水灌洗(每次灌洗5-10 ml，總量≤5-10 ml/kg)。然後負壓吸出灌洗液，各灌洗液重吸收率≥40%。獲得的BALF儲存在消毒的收集器中，以備日後檢查。

Real-time PCR檢測MP

采用經國家食品藥品監督管理局批準的實時聚合酶鏈反應(PCR)方法(廣州達安基因有限公司)實時檢測MP [7］．簡單地，將BALF樣品搖勻，離心，然後除去上清液。收集沉澱物，與50 μL DNA提取液混合，100℃孵育10分鍾，12000 rpm離心5分鍾。在7600實時PCR體係(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中，使用引物和探針(Daan Gene Co.)進行PCR擴增。PCR條件為:93℃，2 min;93°C 45 s, 55°C 60 s, 10次循環;30個循環，93°C 30秒，55°C 45秒。用不同濃度的標準對照樣品繪製定量曲線。

檢測晚期糖基化終產物受體CARDS TX、HMGB1、TLR2、TLR4、MyD88、TLR6和CD14 mRNA表達

BALF樣品4℃15,000 × g離心5 min，管底加入0.5 ml Trizol (Aidlab Biotechnologies Co.， Beijing, China)沉澱。提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。real-time PCR檢測CARDS TX、RAGE、TLR2、TLR4、MyD88、TLR6、CD14的mRNA表達。卡TX使用pdhA作為內部參考，其他卡使用18 s作為內部參考。基因表達采用比較周期閾值(Ct)法評估。mRNA的相對量由管家基因pdhA的Ct值減去這些基因的Ct值或18 s (ΔCt)來確定。mRNA的表達量相對於pdhA或18 s mRNA (2^−ΔΔCt)，以平均值±SEM表示。引物序列如表所示1．

ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β水平

ELISA法檢測BALF中細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β的含量。具體步驟根據製造商的說明書在商用ELISA試劑盒(Neobioscience，深圳，中國)中進行。

統計分析

數據分析與SPSS 24.0版本的Windows (IBM公司，阿蒙克，紐約，美國)。計量資料呈正態分布且方差齊的，用均數±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗。相關分析采用Pearson相關分析。分類資料采用卡方檢驗進行分析。一個P值< 0.05為有統計學意義。

卡TX和HMGB1 mRNA表達水平及其相關性

MPP組CARDS TX和HMGB1 mRNA的平均表達量均顯著高於對照組(兩者均高於對照組)P< 0.05、表2)．MPP組HMGB1與CARDS TX mRNA表達呈正相關(r= 0.376,P< 0.05,無花果。1)．

MPP組與對照組TNF-α、IL-1β水平比較

MPP多見於學齡及學齡前兒童，而支氣管異物多見於嬰幼兒。為避免年齡的影響，我們選擇了20例MPP患兒和10例4-7歲異物患兒(對照)進行進一步比較。MPP組TNF-α和IL-1β的平均水平均顯著低於對照組(p < 0.05)P< 0.05、表3.)．

MPP組與對照組TLR2、TLR4、RAGE、MyD88、TLR6、CD14 mRNA表達水平比較

MPP組BALF中TLR2、MyD88和CD14 mRNA水平均顯著高於對照組P< 0.05、表4)．而TLR4、RAGE、TLR6的相對表達量在兩組間無明顯差異。

MPP組卡TX和HMGB1與TLR2、MyD88和CD14的相關性

MPP組BALF中CARDS TX mRNA表達與TLR2、MyD88、CD14 mRNA表達呈正相關(r= 0.665, 0.483, 0.639;所有P< 0.05)。HMGB1 mRNA表達也與TLR2、MyD88、CD14 mRNA表達呈正相關(r= 0.723, 0.668, 0.707;所有P< 0.05、表5)．

近年來，MPP和RMPP的報告逐漸增加，包括這些條件如何威脅兒童生命的報告[2，8］．然而，RMPP的具體機製尚不清楚。目前認為該機製與MP耐藥、免疫功能障礙、混合感染、MP負荷過重、黏液栓劑、CARDS TX [9］．

卡TX是MP產生的一種重要毒素^3.．一些將靈長類動物暴露於MP和card TX的研究顯示，肺部出現了類似的組織病理學變化[10］．HMGB1是炎症的重要標誌。HMGB1參與MPP發生發展的免疫過程，並與MPP的嚴重程度相關[4，11］．我們研究經支氣管鏡檢查及支氣管肺泡灌洗診斷為MPP的兒童。我們發現MPP組BALF中CARDS TX和HMGB1 mRNA表達量明顯高於對照組。這一發現與Ding等人的研究一致[4和Li等人[11］．HMGB1與CARDS TX呈正相關，提示MP可能通過CARDS TX介導細胞損傷，刺激HMGB1釋放，從而導致肺部炎症。

TNF-α是在各種炎症因子刺激下分泌的最早的炎症因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生。TNF-α可激活繼發性炎症介質的產生，如IL-1β，進而促進T細胞的信號傳遞，啟動炎症反應。研究表明MP和card TX可刺激促炎細胞因子的產生，如TNF-α和IL-1β [11，12］．TNF-α和IL-1β也可刺激單核巨噬細胞向細胞外環境積極分泌HMGB1，發揮促炎作用[13］．然而，我們的研究顯示，MPP組BALF中TNF-α和IL-1β水平顯著低於對照組。這可能是因為TNF-α和IL-1β是早期炎症因子。MPP組病程較長，對照組異物刺激也可引起炎性細胞因子的產生。大多數有異物的兒童在攝入異物後立即行支氣管鏡檢查。這進一步表明HMGB1是晚期炎症因子。

HMGB1的典型受體有RAGE、TLR2和TLR4 [14］．TLRs(除TLR3外)可激活myd88依賴的通路，介導活躍的炎症反應[15］．鼻內接種MP小鼠的研究表明，巨噬細胞通過MP表麵TLR識別MP的特異性抗原[16］．然後激活myd88 -核因子-κB信號通路，然後清除肺部入侵的MP。TLR和MyD88的降低破壞了巨噬細胞清除MP的能力，提示TLR-MyD88-核因子-κB信號通路在巨噬細胞清除肺部MP的過程中起重要作用。我們的研究也顯示，MPP組患兒BALF中TLR2和MyD88的相對表達量明顯高於對照組。TLR2和MyD88 mRNA表達與CARDS TX和HMGB1 mRNA表達呈正相關。而兩組間TLR4、RAGE mRNA表達差異無統計學意義。提示MP感染後TLR2與HMGB1結合通過MyD88通路發揮作用，參與MP發病機製。

TLR6也是TLR家族的一員。TLR6在結構上與TLR2高度同源，通過與TLR2形成異二聚體參與配體識別[17］．CD14也是多種TLR的共受體。CD14作為TLR2的共受體，可以提高對外界病原體的敏感性，促進與配體的結合[18，19］．他等人[20.]表明脂質相關膜蛋白尿道支原體通過TLR1、TLR2、TLR6和CD14激活myd88依賴通路中的核因子-κB。我們的研究顯示，MPP組BALF中CD14的相對表達量明顯高於對照組。CD14 mRNA表達與CARDS TX、HMGB1 mRNA表達呈正相關。而MMP組TLR6的相對表達量與對照組差異無統計學意義。這些發現提示CD14作為TLR2的共受體參與了MPP的發病機製。

綜上所述，MP感染後，CARDS TX刺激HMGB1的釋放，HMGB1依賴TLR2/CD14/MyD88通路激活下遊各種信號通路。這導致炎症和免疫反應。然而，本研究也存在一定的局限性。本研究樣本量小，研究的細胞因子有限。臨床樣本容易受到年齡、免疫功能等個體差異以及治療等方麵的影響。在未來的研究中，需要更大的樣本量和基礎實驗研究來研究MP感染，特別是難治性支原體感染的免疫發病機製。

所有數據都是可用的。

BALF:

支氣管肺泡灌洗液

卡TX:

社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素

CD14:

聚類分化14

HMGB1:

高遷移率組箱蛋白

IL-1β:

Interleukin-1β

MPP:

肺炎支原體肺炎

MyD88:

髓係分化因子88

聚合酶鏈反應:

聚合酶鏈反應

憤怒:

晚期糖基化終產物受體

TLR:

toll樣受體

TNF-α:

腫瘤壞死因子-α

感謝來自Edanz集團(中國)Liwen Bianji的Ellen Knapp博士www.liwenbianji.cn/ac)，以編輯該手稿草稿的英文文本。

本研究由蘇州市社區發展科技項目資助，項目資助項目編號:SS201535)。

作者指出

1. 樊玉傑和丁穎對這項工作做出了同等的貢獻。

從屬關係

1. 215003蘇州大學附屬蘇州大學兒童醫院傳染病科

   樊玉傑，丁穎，李玉琴，張丹丹，於敏，周衛芳，孔曉星

貢獻

YF和YD開展分子遺傳學研究，參與序列比對，並起草了手稿。YL、DZ、MY收集分析臨床資料，參與序列比對。WZ和XK設計實驗並撰寫實驗稿。所有作者閱讀並批準最終稿。

相應的作者

對應到魏芳周或Xiaoxing香港．

倫理認可和同意參與

本研究經蘇州大學兒童醫院機構人性倫理委員會批準進行。所有參與本研究的受試者或監護人均獲得知情同意。

同意出版

所有作者都已閱讀並批準了內容，並同意將其提交期刊考慮發表。

相互競爭的利益

作者聲明他們之間沒有利益衝突。

出版商的注意

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