110例Prader-Willi綜合征的遺傳亞型及表型特征分析

背景

普瑞德-威利綜合征(PWS)是由15q11-q13染色體父係表達基因受損引起的一種複雜疾病。關於PWS遺傳亞型之間的表型差異，已有不同的研究報告。

方法

通過MLPA和MS-MLPA檢測，從2013年7月至2021年12月納入的8572名兒童患者中，共診斷出110例PWS患者。通過基因組cnv測序確定非典型缺失。采用微衛星基因分型對母體單係二體症(UPD)進行分組。收集表型-基因型相關性的臨床數據。21例患者接受生長激素(GH)治療，並評估和比較人體測量學和實驗室參數。

結果

在遺傳方麵，110例PWS患者包括29例I型缺失，56例II型缺失，6例非典型缺失，11例UPD異二體，8例UPD等二體。UPD組產婦年齡明顯高於UPD組(31.4±3.4)vs27.8±3.8歲)，焦慮程度較高(64.29%)vs26.09%)和自閉症性狀(57.14%)vs26.09%)，色素減退較少(42.11%)vs68.24%)和皮膚挑傷(42.86%)vs71.01%)高於刪除組。I型缺失組診斷年齡較早(3.7±3.3)vs(6.2±3.2)年)，多見於言語延遲(95.45%)vs63.83%)。UPD組焦慮傾向較高(83.33%)vs50%)高於異二組性。GH治療1年顯著提高了身高SDS(−0.43±0.68)vs- 1.32±1.19)和IGF-I(- 0.45±0.48)vs−1.97±1.12)。甲狀腺功能和糖/脂代謝未見明顯變化。

結論

我們從一個大型的中國兒科患者隊列中探索了生理、心理和行為表型-基因型之間的關聯，以及GH治療對PWS的影響。我們的數據可能促進兒科醫生對PWS的認識和早期診斷。

普瑞德-威利綜合征(PWS;OMIM#176,270)是一種複雜的遺傳疾病，由染色體15q11-q13上的印跡基因缺乏父係表達引起。據估計，產後ws的患病率為10,000 - 30,000活產的1/ 3 [1］．PWS有幾個遺傳亞型:父係缺失(65-75%)、母係單係二體障礙(20-30%)、印跡中心缺陷(1-3%)和其他罕見的父係15號染色體易位病例(0.1%)[2］．在15q11-q13染色體上發現了5個常見的斷點區域(BP1-BP5) [3.］．PWS的父係缺失通常是反複發生的，包括BP1-BP3 (I型)和BP2-BP3 (II型)，有時不典型，缺失大小或大或小[4，5，6］．母體UPD的發生是由於雌性配子發生時的減數分裂錯誤造成的:等二體是由減數分裂II錯誤和後來的單倍體挽救造成的;異質組係由減數分裂I型錯誤引起，無交叉事件;混合UPD與有交叉事件的減數分裂I錯誤有關[7，8］．

PWS是一種多係統疾病，隨著年齡的增長表型發生顯著變化。嬰兒張力減退是其特點，表現為啼哭無力，吸吮不良，發育不良。男性常因性腺機能減退而隱睾[9］．在兒童早期，如果不吃任何食物，他們會逐漸表現出過度的食欲和肥胖[10］．發育遲緩和/或智力障礙(DD/ID)表現為運動/語言技能延遲和學習問題[1］．行為和心理問題很常見，包括固執、強迫、發脾氣、摳皮、焦慮和自閉症特征[11］．矮小的身材和小的手/腳是由生長激素缺乏引起的[12］．下丘腦功能障礙是多種症狀的基礎，包括暴飲暴食、體溫不穩定、垂體激素缺乏、高痛閾和睡眠呼吸暫停[13］．麵部畸形和色素沉著在PWS患者中也很常見[2］．到目前為止，已經報道了PWS的UPD和缺失類型之間的表型差異，顯示出不一致的結果。UPD和刪除子類型之間的區別仍然不太清楚。

在本研究中，我們介紹了中國東北地區8,572例兒童患者中診斷出的110例PWS病例的總體數據。對不同遺傳亞型間的表型性狀進行評價和比較，以探討可能的相關性。同時評價了21例生長激素治療的效果。

病人

2013年7月至2021年12月，中國醫科大學附屬盛京醫院兒科門診和新生兒病房住院患者共納入了8,572例有DD/ID和/或疑似PWS特征的患者。納入標準為:DD/ID發育商(DQ)和/或智商(IQ) < 70;且≥1項①吸吮和喂養不良的新生兒張力不足，②男性隱睾症,③身材矮小，手/腳小，④肥胖伴暴飲暴食和極端的食物尋求，疑似PWS特征。有其他明確遺傳病因的病例(如脆性X染色體綜合征、唐氏綜合征等)．)，排除異常神經影像學和代謝篩查。參與和發表的書麵知情同意來自一名法定監護人。我們遵循《赫爾辛基宣言》，所有方案均由中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準。

表型評價

記錄受試者的人口統計數據，包括產婦年齡、年齡、性別、身高、體重和BMI。收集的臨床特征包括新生兒張力不足、喂養問題、麵部畸形、淺色頭發和皮膚、唾液粘性、睾丸隱睾、中樞和/或阻塞性睡眠呼吸暫停、癲癇、暴飲暴食、發育裏程碑和語言技能延遲、學習障礙、心理社會和行為問題、疼痛敏感性降低和醫療幹預。使用Gesell發育量表評估DQ [14］．采用韋氏兒童智力量表評估合作兒童的智商[15］．使用兒童自閉症評定量表評估自閉症特征[16］．從醫院實驗室中心收集重組人生長激素治療1年以上患者的實驗室參數，包括血清胰島素樣生長因子I (IGF-I)、血清促甲狀腺激素(TSH)、遊離甲狀腺素(fT4)、遊離三碘甲狀腺原氨酸(fT3)、空腹血糖和胰島素、總甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白(LDL)。根據中國人群的參考值計算身高、體重、BMI和IGF-I的標準差評分(SDS)值[17，18，19］．

多重連接依賴探針擴增(MLPA)檢測

使用血液基因組DNA迷你試劑盒(Axygen, CA, USA)從外周血樣本中分離基因組DNA。MLPA P245試劑盒(MRC-Holland, Amsterdam, Netherlands)用於按照製造商說明篩選常見微缺失綜合征。簡單地說，DNA在98°C變性5 min，在60°C與探針雜交16 h。在54°C結紮15 min，然後用通用熒光引物PCR擴增連接的探針。使用3730遺傳分析儀(Applied Biosystems, CA, USA)進行毛細管電泳分離片段，並使用Coffalyser軟件(MRC-Holland)進行分析。

甲基化特異性MLPA (MS-MLPA)檢測

MS-MLPA ME028試劑盒(MRC-Holland)按照製造商的說明用於PWS的診斷。變性和雜交與MLPA試驗相同。用或不使用甲基化敏感限製性內切酶對雜交樣品進行結紮鐵道I在48°C孵育30分鍾，采用與MLPA相同的PCR方法進行擴增。使用3730基因分析儀(Applied Biosystems)分離片段，並使用Coffalyser軟件(MRC-Holland)進行分析。

基因組CNV-sequencing

如前所述，通過基因組cnv測序來定義非典型缺失[20.］．簡單地說，將50 ng基因組DNA進行片段化，通過末端填充、適配器連接和PCR擴增構建DNA文庫。使用文庫準備套件(Berry Genomics, China)構建DNA文庫，並使用NextSeq 500平台(Illumina, San Diego, CA, USA)進行測序，生成約800萬份長度為36 bp的原始reads。使用Burrows-Wheeler算法將所有序列與GRCh7/hg19基因組進行比對。映射的讀取被逐步分配到染色體上，通過比較在同一流程細胞中運行的所有測試樣本之間的bin計數來評估拷貝數的變化。

微衛星標記的基因分型

采用熒光引物對15q11-q13染色體上10個多態微衛星標記進行多重PCR分型1．利用3730基因分析儀(Applied Biosystems)對擴增子進行純化(Axygen)和毛細管電泳分離，並使用GeneMapper 4.1軟件(Applied Biosystems)進行分析。

統計分析

所有的統計分析均采用SPSS-V-23.0 (IBM公司，美國)進行。正常資料用平均數±標準差或數(百分比)表示。采用夏皮羅-威爾克檢驗檢驗連續變化。兩組比較采用卡方檢驗、非參數Mann-Whitney U檢驗或Student t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

110例PWS患者的遺傳診斷

在登記的8,572個人中，7910名DD/ID患者通過P245篩查常見微缺失綜合征，然後對15q11.2缺失的患者進行ME028確認。檢出15q11.2缺失99例(99/ 7910,1.25%)，其中父係缺失59例(59/ 999,59.60%)診斷為PWS。P245-ME028檢測PWS父係缺失的診斷率為0.75%(59/ 7910)。662例疑似PWS特征患者采用ME028直接診斷，診斷率為7.70%(51/662)。這51例PWS患者中有32例(32/ 51,62.75%)父係缺失，19例(19/ 51,37.25%)母係UPD。對110例PWS患者的遺傳和表型特征進行了進一步的分析。1)．

91例父係缺失患者的遺傳亞型分析

ME028含有染色體15q11-q13上的BP1到遠端BP3基因的密集探針(如圖所示)。2A). 91例父係缺失患者中29例(29/91,31.87%)為I型，56例(56/91,61.54%)為II型，6例(6/91,6.59%)為非典型缺失(圖1)。2B). ME028試驗的代表性數據如圖所示。2C.對ME028缺失超出檢測範圍的患者進行基因組cnv測序，2例BP4缺失擴大，1例BP5缺失(圖5)。3.A).所有PWS患者g帶核型均正常，除缺失最大的患者出現45,XY,der(12)t(12;15)(q24;q13)， -15染色體易位(圖4)。3.B)。

19例產婦UPD的遺傳亞型分析

利用多重熒光PCR對19例產婦UPD患者進行多態微衛星基因分型分組。4)．當母體雜合子時，微衛星標記是有用的。母係遺傳兩種等位基因均為雜合的為異二體，母係遺傳兩種等位基因均為純合的為同二體。每個個體的信息微衛星在遺傳模式上一致，表明15q11-q13區域沒有交叉事件。因此，在15q11-q13將19例PWS合並產婦UPD患者分為11例(11/ 19,57.89%)異位組和8例(8/ 19,42.11%)異位組。

104例不同遺傳亞型患者的表型特征

104例不同遺傳亞型PWS患者的表型信息見表1．新生兒期幾乎普遍存在張力減退(100%)、喂養問題(94.23%)和隱睾(90%)。運動遲緩(100%)、身材矮小(85.29%)和唾液粘稠(79.41%)自嬰兒期就普遍存在。學習障礙(97.59%)、語言障礙(74.70%)、暴飲暴食(73.49%)在兒童時期常見。老年患者多以飽腹感不足(86.67%)、性腺功能減退(90.91%)、青春期不完全/延遲(81.82%)為主。UPD組產婦年齡明顯高於缺失組(31.4±3.4)vs27.8±3.8年，P< 0.01)。焦慮(64.29%vs26.09%,P< 0.01)和自閉症性狀(57.14%)vs26.09%,P< 0.05)在UPD中的發生率高於缺失組。相反，色素減退(41.18%)vs67.95%,P< 0.05)和皮膚挑傷(42.11%)vs69.05%,P< 0.05)的缺失率高於UPD組。I型缺失組在早期診斷(4.3±4.9)vs6.2±3.2年，P< 0.05)，言語延遲發生率較高(95.45%)vs63.83%,P< 0.05)高於II型缺失組。雖然差異無統計學意義，但焦慮發生率較高(83.33%)vs50%,P= 0.20)在15q11-q13同源性UPD組中較異質性UPD組多。

6例非典型缺失患者的表型特征

6例非典型缺失小於II型或大於i型，表型特征見表2．患者1保留了三個基因(MKRN3，MAGEL2而且NDN)與II型患者相比，表現出輕度PWS的基本特征。患者2(陽性NIPA1而且OCA2)和患者3(陽性NIPA1)與I型相比缺失較小，但與大多數PWS患者之間沒有顯著差異。患者3呈低色素沉著陽性，而患者2無。患者4和患者5的BP4缺失擴大。不平衡染色體易位患者6對BP5進一步缺失。他們表現出嚴重的表型，如患者4和患者6的管飼，患者6的語言缺失。未見明顯異常。

GH治療21例PWS的療效觀察

21例(21/110,19.09%)患者接受重組人生長激素治療1年以上。GH治療開始的中位年齡為2.1歲(範圍0.9-4.8歲)。GH治療前後的人體測量學和實驗室參數見表3.．高度SDS顯著增加(−0.43±0.68)vs−1.32±1.19，P< 0.01)，但在體重和BMI之間無顯著差異。GH治療後血清IGF-I SDS顯著升高(−0.45±0.48vs−1.97±1.12，P< 0.01)。甲狀腺功能，從TSH, fT4和fT3水平評估，沒有明顯改變。糖脂代謝參數無明顯變化。

印跡基因通過甲基化調控，根據親本來源進行差異表達。MS-MLPA通過檢測拷貝數和甲基化比，在印跡疾病的診斷中具有很大的優勢[6，21］．在本研究中，ME028對662例疑似PWS特征的患者的診斷率為7.70%，這些患者包括伴有喂養問題的新生兒缺氧、男性隱睾、矮小的手/腳、肥胖伴有暴飲暴食和極度食物尋求。這些PWS特征值得兒科醫生高度重視，MS-MLPA被推薦為PWS快速診斷的一級分子技術。本研究中產婦UPD的比例為37.25%，高於常規的20-30% [2]，與最近一項大型多地點隊列研究的36.27%相似[22］．這可能是由於現在的產婦年齡較高或以前的UPD診斷率較低。在7910例無法解釋DD/ID的個體中，MLPA P245篩查在一次識別多個微缺失綜合征方麵是劃算的。在我們的研究中，P245對15q11.2缺失的診斷率為1.25%，低於10026例中國兒童染色體微陣列發育障礙患者的2.07% [23]，但遠高於29,085例無法解釋發育遲緩的西方兒童的0.14% [24］．差異可能來自種族、納入標準或檢測方法。P245-ME028檢測父係缺失型PWS的診斷率為0.75%，本組未檢出母係UPD型PWS。

ME028的探針包圍BP1到遠端BP3有助於父係缺失PWS的亞分類。超出BP3遠端的非典型缺失通過cnv測序確定。父係缺失的91例PWS分為I型的31.87%、II型的61.54%和非典型缺失的6.59%。有關父係缺失PWS亞型的研究有限。一項包括303名缺失性PWS患者(主要是白種人)的多地點隊列研究顯示，38.9%為I型、54.5%為II型和6.6%為非典型缺失[22］．我們的數據在第一類中相對較低，在第二類中較高。需要更多的大規模研究來進一步完善這一比例。PWS伴母體UPD可根據減數分裂錯誤和交叉事件進行分組[7，8］．本研究通過微衛星基因分型，在15q11-q13區域發現57.89%的異二體和42.11%的同二體，分別對應減數分裂I和II錯誤。這增加了目前尚不清楚的關於PWS與產婦UPD亞型比例的數據。未評估由遠端15q交叉事件引起的混合形式的UPD。

對不同PWS基因亞型的臨床特征進行評價和比較。總的來說，普遍的表型包括新生兒張力減退、進食問題、運動遲緩、學習障礙和男性隱睾。女性生殖器發育不良很容易被忽視和不被評估。對不同人群的研究比較了UPD和PWS缺失類型之間的表型，結果顯示差異包括產婦年齡、色素低下、出生長度、智商得分、自殘、精神病、痛閾和睡眠障礙[25，26，27，28，29］．我們的UPD患者比缺失患者有更高的產婦年齡，更高的焦慮和自閉症特征的頻率，更低的色素沉著和皮膚擦傷的頻率。其他先前指出的差異沒有被發現，包括更高的UPD診斷年齡，或更頻繁的進食問題，溫度不穩定，睡眠障礙，麵部畸形在缺失組。我們的I型患者診斷年齡更早，語言延遲頻率更高，表明與II型患者相比，更大的缺失區域對應更嚴重的症狀。我們沒有發現I型和II型PWS組之間的行為差異，而之前一項對12個I型和14個II型PWS個體的研究顯示，I型PWS組的適應性更差，強迫行為更常見[29］．UPD組中異二體和同二體之間的表型變異很少報道。純合子區致病變異引起的魚鱗病和泰-薩克斯病的常染色體隱性遺傳病已有個別病例的報道[30.，31］．我們沒有在UPD組中發現額外的表型。chr 15同型組的產婦焦慮發生率高於異型組。這在以前沒有報道過，需要在更多伴有產婦UPD的PWS個體中進行確認。

非典型缺失的患者對於理解不同缺失區域的功能是有幫助的。PWS的許多標誌性特征在患者1保留MKRN3，MAGEL2而且NDN與II型患者的基因比較，表明SNRPN-SNORDPWS發病的區域已足夠。患者2與患者3在OCA2與低色素表型相關的基因。的15q11.2 BP1-BP2微缺失NIPA1，NIPA2，CYFIP1,TUBGCP5基因導致Burnside-Butler綜合征，伴隨大腦形態、行為和認知異常[32］．BP1-BP2部分缺失的患者2及患者3 (NIPA1保留,TUBGCP5刪除)對大多數PWS患者是無法區分的。先前關於PWS擴大缺失的報道證實了心血管、腎髒或其他先天性異常[33］．3例BP4和BP5遠端缺失擴大的患者表現出嚴重的表型，包括管食和語言缺失，沒有結構異常。

生長激素治療在身體組成、精神運動發展、認知、適應功能和線性生長方麵的益處已被證實，而對血糖參數、脂質譜和血壓無不良影響[34］．在本隊列中，19.09%的PWS患者接受了一年以上的生長激素治療，並有完整的實驗室數據。我們沒有將這些患者分成亞型。顯著改善了身高和血清IGF-I。在非常年輕的PWS患者中發現了中樞性甲狀腺功能減退，並隨著年齡的增長而改善[35］．我們的TSH、fT4、fT3數據在GH治療前後均在參考範圍內，無明顯變化。葡萄糖和脂質代謝參數也在參考範圍內。這可能是由於患者營養階段相對較早所致。

本研究提供了從8,572例中國兒童個體中診斷的110例PWS患者的詳細遺傳和表型特征。我們添加了更多關於表型與各種遺傳亞型的關聯的數據，這有助於提高對這種複雜神經發育障礙的認識。

本研究中使用的數據集可以根據合理的要求從通訊作者處獲得。

漿:

二氏綜合征

烏利希期刊指南:

單性生殖的二體性

“大酒店”:

生長激素

SDS:

標準差評分

英國石油公司:

斷點

DD / ID:

發育遲緩和/或智力障礙

DQ:

發展商數

智商:

智商

IGF-I:

胰島素樣生長因子I

TSH:

促甲狀腺激素

fT4:

遊離甲狀腺素

發生:

遊離三碘甲狀腺氨酸

低密度脂蛋白:

低密度脂蛋白

MLPA:

多重結紮依賴探針擴增

MS-MLPA:

Methylation-specific MLPA

我們要感謝參與這項研究的個人。

本研究獲得國家重點研發計劃項目(2021YFC1005303, 2021YFC1005304)和中國醫科大學新醫學技術與項目(112-3110210717)資助。

作者指出

1. 張璐和劉小亮對這項工作做出了同樣的貢獻。

作者和隸屬關係

1. 110004沈陽市和平區三好街36號，中國醫科大學附屬盛京醫院臨床遺傳科

   張璐，劉小亮，張媛媛，高海明，張碧軍，崔婉婷，趙燕燕

2. 中國醫科大學附屬盛京醫院發育兒科，中國沈陽

   Yunjing趙

3. 計算與綜合生物學中心，麻省總醫院，波士頓，馬薩諸塞州，美國

   青衣王

貢獻

YanyanZ, LZ和XL設計了這項研究。LZ、XL和YunjingZ收集臨床資料。QW進行統計分析。yuyuananz和HG進行MLPA分析。BZ和WC進行cnv測序。XL和LZ起草了手稿。YanyanZ和LZ對手稿進行了修改。所有作者都批準了最終版本。

相應的作者

對應到Yanyan趙．

倫理批準和同意參與

本研究按照赫爾辛基宣言進行，並由中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會(2021PS523K)批準。獲得法定監護人的書麵知情同意。

發表同意書

不適用。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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