與室間隔缺損(VSDs)相關的變異研究突出了巴基斯坦人群獨特的遺傳結構

背景

室間隔缺損(VSDs)是生命最初幾個月心髒異常導致死亡的主要原因之一。據報道，新生兒VSD的患病率高達4%。盡管VSDs的藥物、治療和外科手術都取得了顯著的進展，但由於複雜的遺傳和環境相互作用，VSDs的遺傳病因學仍處於初級階段。

方法

350名受試者(200名VSD兒童和150名健康對照)從不同的兒童心髒單位招募。收集兒科臨床和人口統計學數據。采用四- arms PCR和PCR - rflp方法對rs1017 (ISL1)、rs7240256 (NFATc1)、rs36208048 (VEGF)、HEY2的變體、rs11067075 (TBX5)和rs1801133 (MTHFR)基因進行分型。

結果

結果表明，在病例中，ISL1基因rs1017 (g.16138A > T)的T和A等位基因等位基因頻率分別為0.42和0.58，對照組等位基因頻率分別為0.75和0.25。AA、TA和TT基因型的頻率分別為52%、11%和37%，對照組分別為21%、8%和71%。對於NFATc1變異rs7240256，病例次要等位基因頻率(MAF)為0.43，對照組為0.23。VEGF基因變異的基因型頻率在病例中分別為0% (A)、32% (CA)和68% (CC)，在對照組中分別為0.0%、33%和67%。病例C和A的等位基因頻率分別為0.84和0.16，對照組分別為0.83和0.17。病例的TBX5多態性rs11067075 (G . 51682g > T)的等位基因頻率分別為0.44和0.56，對照組為0.26和0.74。在我們的兒科隊列中，我們沒有檢測到HEY2基因變異(g.126117350A > C)的存在。對於MTHFR基因rs1801133 (g.14783C > T)變體，病例的基因型頻率分別為25% (CC)、62% (CT)和13% (TT)，而對照組的基因型頻率分別為88%、10%和2%。在巴基斯坦兒童隊列中發現ISL1、NFATc1、TBX5和MTHFR變異與VSD相關，而在我們的隊列中完全不存在VEGF和HEY2變異。

結論

我們建議，對巴基斯坦人群進行心髒發育基因遺傳標記的更廣泛的基因篩查項目將有助於降低VSDs的風險。

青少年最明顯的心髒異常是室間隔缺損(VSDs)，因為它們包含約40%的遺傳性心髒異常以孤立缺陷的形式存在。室間隔缺損是嬰兒出生後一個月內死亡的主要原因之一[1］．新生兒室間隔缺損的患病率據報道高達4% [2］．室間隔缺損可表現為孤立的心髒疾病，也可作為其他幾種複雜畸形的組成部分，包括法洛四聯症(TOF)和其他綜合征[2］．VSD1 (VSD1)GATA4), VSD2 (CITED2)及VSD3 (NKX2.5) [3.］．盡管VSDs的藥物、治療和外科手術都取得了顯著的進展，但由於複雜的遺傳和環境相互作用，VSDs的遺傳病因學仍處於初級階段。某些轉錄因子，被稱為先驅轉錄因子，在細胞編程啟動和促進細胞分化和規範過程中起著重要作用。的ISL1基因是心肌細胞分化的重要先導因素之一。ISL1是一種在第二心野瞬時表達的LIM同源域轉錄因子[4］．在心髒發育的最初階段，ISL1作為祖細胞的標記。人類的ISL1基因位於染色體5q11.1上[5］．一個ISL1在小鼠模型中的基因敲除實驗已經證明了該基因的重要性，敲除小鼠胚胎由於心髒發育缺陷而死亡[6］．一個SNP, rs1017 (NG_023040.1:g.16138A > T)在ISL1已報告與人類先天性心髒病有關[7］．NFATc1(活化T細胞核因子，細胞質1)是一種轉錄因子，屬於Rel家族，是心髒瓣膜發育所必需的[8］．基因表達在前瓣心內膜細胞是由NFATc1通過激活其異質性啟動子[9］．人類的NFATc1基因位於18q23染色體上。研究報告了基因突變NFATc1為房室間隔缺損(AVSD)的原因[10］．多態性rs7240256 (NG_029226.1:g.23449該基因的T > C)被報道為VSD的危險因素。血管內皮生長因子(VEGF)在血管係統的形態發生和內皮細胞分化中起關鍵作用[11］．人類的VEGF該基因位於染色體6p21.1上。VEGF在老鼠身上進行的敲除實驗已經導致55%的動物突然死亡。哪怕是一份VEGF基因不足以使突變小鼠存活[12］．在人類中，調節區域的多態性VEGFrs36208048 (NG_008732.1:g.3877C > A)已報道與VSD有關[13］．T-Box轉錄因子(包括TBX1、TBX2、TBX3、TBX5、TBX18和TBX20)在心內膜形成和心室成熟等心髒發育過程中發揮著重要作用。因此，這些重要轉錄因子的變異會導致心髒疾病也就不足為奇了。14］．TBX5主要是心髒前肢發育。它還作為與心肌細胞成熟相關的基因的轉錄激活因子。人類的TBX5基因位於染色體12q24.21上[15］．早期的研究表明rs11067075 (NG_007373.1:g.51682G > T)與TBX5和房間隔缺損16,17］．

YRPW基序蛋白2相關的分裂毛狀增強子(Hey2基因)屬於一個由基本螺旋環螺旋(bHLH)轉錄因子組成的HEY家族成員[18］．心髒發育的關鍵一步是及時準確地添加心髒祖細胞。HEY在心髒祖細胞動力學中起調節作用[19］．人類的HEY2基因位於染色體6q22.31上。基因變異HEY2基因導致心髒缺陷[20.］．之前的一項研究報道了僅在VSD患者中出現的一種新的變異(NC_000006.10:g.126117350A > C) [21］．MTHFR，是一種亞甲基四氫葉酸還原酶，是一種催化葉酸最初循環形式合成的酶，而葉酸又充當甲基的供體，使同型半胱氨酸再甲基化為蛋氨酸[22］．人類的MTHFR該基因位於染色體1p36.22上。一種常見的變異MTHFR， rs1801133 (NG_013351.1:g.14783C > T)，之前已經研究過[23]，最近發表的一項薈萃分析顯示，rs1801133與心髒病風險有關聯[24］．不同民族間的遺傳變異是人類遺傳疾病研究的一個混雜因素。在全球範圍內，人們進行了基因分析，以檢測疾病與致病基因之間的關係。以同樣的方式，在世界不同地區也進行了VSD的遺傳研究。本研究的目的是確定屬於不同基因的變異的關聯，包括ISL1: rs1017 (NG_023040.1:g.16138A > T)，NFATc1: rs7240256 (NG_029226.1: g.23449T > C),VEGF: rs36208048 (NG_008732.1:g.3877C > A)，TBX5: rs11067075 (NG_007373.1:g.51682G > T)，HEY2:(NC_000006.10:g.126117350A > C)和MTHFR: rs1801133 (NG_013351.1:g.14783C > T)，帶有VSD。識別與VSD相關的不同遺傳多態性將有助於VSD患者的監測和篩查，促進遺傳谘詢，並可能有助於減少該疾病在當地地區的流行。

倫理批準，書麵同意和研究對象的招募

本研究獲得了巴基斯坦拉合爾旁遮普省大學微生物和分子遺傳學研究所當地研究倫理委員會的批準(批準號# MMG1958-13/10/2020)。從患者父母或監護人處取得書麵知情同意。從巴基斯坦拉合爾的各個兒科心髒病房收集了200個分離的室間隔缺損患者樣本(頰拭子和血液)。150名沒有心髒缺陷的健康對照組納入這項研究。采樣時間為2018年至2020年。

包含/排除標準

通過心電圖選擇診斷為孤立性室間隔缺損的患者。通過二維和多普勒超聲心動圖獲取心髒圖像，以確定分流的大小、缺陷(心髒的整個結構)的大小和位置。在心導管置管過程中，測量血流量、Qp/Qs比值以確定分流管的大小。超聲心動圖由兒科心髒病專家進行。排除了室間隔缺損綜合征、其他心髒問題和感染性疾病(HBV/HCV/HIV血清陽性)的病例和對照組。

數據收集

根據不同參數收集患兒資料:血液學參數如WBCs、rbc、Hb水平、血小板計數、血清肌酐(SC)、鈣、鈉、血尿素氮(BUN)、鉀、血清穀丙轉氨酶、膽紅素、血清穀草轉氨酶、血清白蛋白、堿性磷酸酶、γ GT等，人口統計學數據如年齡、親緣婚姻、家族史、妊娠期間產婦Hb水平。在懷孕期間使用藥物等也有記錄。

基因分型

兒童樣本取於EDTA小瓶中，保存於-20°C。從人類白細胞/白細胞中提取基因組DNA。使用Epoch Biotek微板閱讀器(Biotek Instruments, USA)評估提取DNA的質量，並將DNA濃度調整為10 ng/uL.采用四環素引物ARMS PCR技術擴增MTHFR,NFATc1而且TBX5基因(表1)．為HEY2,ISL1而且VEGF基因變異，采用PCR-RFLP技術(表1)．對每個遺傳標記的PCR反應混合物和條件進行優化。PCR和RFLP產物在2%瓊脂糖凝膠上運行。

統計分析

統計分析采用SPSS第22版軟件。病例與對照組的基因型頻率用χ 2檢驗(χ 2檢驗)進行分析²)，而等位基因頻率是通過直接計數計算的。基因型和等位基因頻率以百分比報告。計算定量參數的均值和標準差值。對研究人群進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。當我們分析6個snp時，Bonferroni進行了調整p-value(0.0125)被用作所有分析的顯著性閾值。

患者平均年齡、VSD家族史、患有VSD的兄弟姐妹、血液學參數的描述特征、化學特征和血型分布已在前麵解釋過[25］．對於rs1017 (g.16138A > T)變體ISL1病例的基因型頻率分別為52% (AA)、11% (TA)和37% (TT)，對照組分別為21%、8%和71%(表2)2)．病例中T和A等位基因的頻率分別為0.42和0.58，對照組中T和A等位基因的頻率分別為0.75和0.25 (OR: 0.242, CI: 0.158-0.37，假定值< 0.0001)。隊列的基因型頻率偏離Hardy-Weinberg平衡(假定值: < 0.0001)。顯性和隱性模型的基因型分布見表3.(占主導地位;或:0.21,ci: 0.11-0.39，假定值: < 0.0001，隱性:OR: 0.24 CI: 0.13-0.43，假定值: < 0.0001，等位基因OR: 0.242, CI: 0.157-0.37，假定值: < 0.00013.)．

對於rs7240256 (g.23449T > C)NFATc1基因型頻率分別為4% (CC)、78% (TC)和18% (TT)，對照組分別為1.0%、44%和55%(表2)2)．病例組小等位基因頻率(MAF)為0.43，對照組為0.23 (OR: 2.53, CI: 1.64-3.89，假定值< 0.0001)。優勢模型的OR為0.18,CI為0.09-0.34假定值< 0.0001，在隱性模型中OR為0.24,CI: 0.03-2.23 (假定值: 0.16(表)3.)．對照組基因型頻率為Hardy-Weinberg平衡(假定值: 0.021)。rs36208048 (g.3877C > A)基因分型VEGFAA、CA和CC基因型所占比例分別為0%、32%和68%，對照組為0%、33%和67%(表2)2)．病例中C和A等位基因的頻率分別為0.84和0.16，對照組為0.83和0.17 (假定值0.8577)。對於隊列，基因型頻率顯示偏離Hardy-Weinberg平衡(假定值: 0.066)。對於主要模型，OR為1.06,CI: 0.59-1.92 (假定值0.84)。而隱性模型分析無法進行，由於缺乏純合子基因型的病例和對照組(表3.)．

對於多態性，rs11067075 (g.51682G > T)在TBX5,病例中GG、GT和TT基因型的頻率分別為21%、70%和9%，對照組為56%、36%和8%(表2)2)．病例中T和G等位基因的出現頻率分別為0.44和0.56，對照組為0.26和0.74 (OR: 2.24, CI: 1.47 ~ 3.41 (假定值0.0002)。優勢模型的OR為0.21,CI為0.11-0.38和假定值與隱性模型相比，< 0.0001的OR為0.89,CI為0.33-2.40和假定值0.82(表3.)．對照組的基因型頻率處於Hardy-Weinberg平衡(假定值: 0.60)。對於在HEY2:(g.126117350A > C)，未檢出純合型和雜合型。因此，無法在病例或對照中進行顯性和隱性模型分析。病例和對照組的顯性純合子頻率均為1.0。rs1801133 (g.14783C > T)的基因分型MTHFRCC、CT和TT基因型在病例中的頻率分別為25%、62%和13%，而在對照組中分別為88%、10%和2%(表2)2)．病例T和C的等位基因頻率分別為0.56和0.44，對照組為0.93和0.07 (OR: 10.46, CI: 5.68-19.26，假定值(< 0.0001)。優勢模型的OR為0.04,CI為0.02-0.10 (假定值< 0.0001)，而在隱性模型中，OR為0.14,CI為0.33-0.63和假定值0.002(表3.)．對照組的基因型頻率處於Hardy-Weinberg平衡(假定值: 0.65)。

先天性心髒病的保健負擔在全世界範圍內逐漸增加，特別是在像巴基斯坦這樣的中低收入國家，那裏的治療費用是大多數家庭負擔不起的。一般來說，由於近親結婚率高，巴基斯坦人口在遺傳病調查中表現出顯著的差異，這一事實使這一人口對遺傳學家具有吸引力。遺傳學領域的進展已導致發現複雜疾病和單基因疾病的新的遺傳標記[1］．室間隔缺損是最常見的先天性心髒缺陷，每500個活產兒中就有1個室間隔缺損。VSD的危險因素包括基因變異、家族史、種族和某些環境因素。根據之前研究報告的數據，參與循環係統和心髒發育的基因，如，GATA4、NKX2.5 TBX5,Vegf, mtrr, mthfr, isl1, nfatc1而且CITED2在VSD的病因學中起重要作用[26］．由於在臨床實踐中無法獲得產前和產後的生物標記物，因此確定VSDs的遺傳風險或疾病標記物至關重要。所有的基因(ISL1, NFATc1, VEGF, HEY2,TBX5而且MTHFR)在心血管係統中具有重要的結構和功能。1)．

的ISL1lim同源結構域轉錄因子在胚胎心髒發育中起重要作用。它是負責心室發育的基因之一[26］．基於之前對中國隊列的研究，我們選擇rs1017多態性作為VSD預測的潛在生物標誌物[27］．一項薈萃分析研究表明，這種多態性是心髒病的危險因素[5］．與中國人相比，在白人人群中沒有發現相關性[28］．令人驚訝的是，在目前的研究中，結果顯示在巴基斯坦人群中，小等位基因是VSDs的保護性等位基因。遺傳模型分析證實了這一點。NFATc1對瓣膜和間隔發育有很大影響。早前的一項研究報道了rs7240256純合變異基因型與VSDs的顯著相關性[29］．我們的結果與之前的一項研究一致，rs7240256顯示與VSDs並發症有關[30.］．較高的風險基因型比例是該多態性對瓣膜和間隔發育影響的指標。VEGF是一種參與血管生成的信號蛋白。VEGF的任何功能和結構失調，都可能在VSDs的發病機製中發揮關鍵作用。循環血管係統受VEGF等生長因子的直接影響，這種生長因子的任何正常功能偏離都可能導致嚴重後果[31］．從我們的研究結果來看，選擇的VEGF SNP rs36208048在病例和對照組之間的等位基因頻率沒有顯示出統計學差異，盡管該變體位於基因的啟動子區域，而該啟動子區域是生長因子正常功能的必要部分[13］．

TBX5轉錄因子在心髒發育過程中保持其表達水平，在心室成熟過程中也觀察到其持續表達[15,32］．我們的結果與之前的一項研究一致，TBX5中的rs11067075變體與兒科患者的VSD相關[16］．在我們的研究人群中，我們觀察到病例和對照組中不同的次要等位基因頻率，風險等位基因在變異和結果之間的關聯中發揮作用。優勢模型分析也支持這些結果。在心髒發育通路中，HEY2轉錄因子與NKX2.5、TBX5、GATA4等因子發揮著重要作用[33］．一項針對德國人群的研究報告了HEY C . 293a > C (p.Asp98Ala) (g.126117350A > C)結合域的一個新多態性[21］．由於樣本量小、樣本偏倚和種族差異，本隊列中等位基因和基因型頻率未發現明顯差異。然而，這種變異很少被發現，可能是由於它在HEY2轉錄因子中具有重要的功能位置。DNA、RNA和蛋白質需要一個碳(甲基)進行甲基化和再甲基化，通常由甲基thfr催化。MTHFR還能催化同型半胱氨酸轉化為蛋氨酸。根據之前發表的數據，T等位基因rs1801133 (g.14783C > T)是心髒疾病的危險因素[34,35,36］．據報道，包括埃及人、泰米爾人、伊朗人和中國人在內的不同民族都攜帶與先天性心髒病有關的T等位基因[22,37,38,39,40］．同樣，我們在我們的隊列中得到的結果表明，與對照組相比，風險等位基因在病例中有更高的頻率。這表明T等位基因與當地種族群體中的VSDs有顯著的關聯。

巴基斯坦人口在社會、文化和宗教習俗方麵是獨特的;據報道，它也有很高的血親比例。這使得遺傳研究，特別是對包括性傳播疾病在內的複雜遺傳疾病的研究具有極大的挑戰性，但卻有潛在的回報。雖然可以在全國範圍內征集樣本，但由於資源不足，樣本總數有限。這是第一次嚐試確定可能的關聯的變量在ISL1, NFATc1, VEGF, HEY2,TBX5而且MTHFR在一個巴基斯坦隊列中發現了VSDs基因。

所有的數據都可以從相應的作者處獲得，並且可以根據要求訪問。

房間隔缺損:

心室中隔缺損

VEGF:

血管內皮生長因子

TBOX:

T-Box轉錄

ISL1:

ISLET1

MTHFR:

亞甲基tetrahydrofolate還原酶

SPSS:

社會科學統計資料包

倫敦大學學院心血管科學研究所的Ann Walker教授、Petros Syrris博士感謝他們在稿件撰寫和技術支持方麵的幫助。

這項工作得到了巴基斯坦高等教育委員會Grant # [518-111767-2BS5-019]的支持。

作者和聯係

1. 旁遮普大學微生物學和分子遺傳學研究所，巴基斯坦拉合爾54590

   Sumbal Sarwar, Shabana, Amna Tahir, Zainab Liaqat, Saher Naseer, Rani Summeya Seme, Sabahat Mehmood, Saleem Ullah Shahid & Shahida Hasnain

貢獻

Shabana和sh構思了研究概念，AT, ZL, SN, SM, RSS進行了實驗工作，SS, SUS和Shabana分析了結果並起草了手稿，Shabana對手稿進行了批判性的審查並監督了研究。作者(們)閱讀並批準了最終稿。

相應的作者

對應到Sumbal薩瓦爾或Shabana．

倫理批準和同意參與

本研究獲得了巴基斯坦拉合爾旁遮普省大學微生物和分子遺傳學研究所當地研究倫理委員會的批準(批準號# MMG1958-13/10/2020)。從患者父母或監護人處取得書麵知情同意。所有方法都是根據1964年《赫爾辛基宣言》及其後來的修正案或類似的道德標準進行的。

同意出版

這篇文章的發表不存在利益衝突。

的利益衝突

作者聲明本論文的發表不存在任何利益衝突。

出版商的注意

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