改進罕見病診斷:意大利未診斷罕見病網絡的經驗

背景

對於一些患有罕見病(RDs)的人，仍未發現明確的診斷，並帶來相關的生理、心理和社會後果。未診斷的rd (URDs)不需要專門的臨床中心、出色的分子研究、共同的協議和國家和國際層麵的專門行動;因此，在結構良好的多學科方法基礎上，許多“未診斷的rd計劃”已經逐漸發展起來。

方法

意大利未診斷罕見病網絡(IURDN)於2016年成立，旨在提高居住在意大利的URD患者的診斷水平。六個意大利專門知識中心是該網絡的代表。位於Sanità高等醫院的國家罕見病中心負責協調整個項目。使用軟件phentips收集臨床病例信息。

結果

2016年3月至2019年6月對110例病例進行了分析。這些疾病的發病年齡從產前到51歲不等。情況主要是散發的;幾乎所有患者都有多個器官受累。家族性WES特征13/71例;在一些家庭中，不止一個人受到影響，因此導致20/71個人被調查。導致疾病的變異被確定在兩個案例中，並與以前未描述的表型相關。在5個病例中，新的候選基因被確定，盡管確認試驗還在等待中。在三個家庭中，由於成員缺乏依從性，調查沒有完成，分子調查被暫停。最後，還有三個案件(一個家族)仍未解決。 Twelve undiagnosed clinical cases were then selected to be shared at International level through PhenomeCentral in accordance to the UDNI statement.

結論

我們的結果表明，分子診斷率為53.8 %;這一數值與其他國際研究報告的診斷率相當。收集的病例也與UDNI國際網絡收集的病例合並。這是旨在分享和驗證這一領域知識和經驗的全球倡議的一個獨特例子。IURDN是一項多學科和有用的倡議，連接了國家和國際的努力，旨在對RD患者做出及時和適當的診斷，即使在很長一段時間後仍然沒有得到確診。

罕見病(RDs)是指在歐洲每1萬人中影響不到5人，在美國影響不到20萬人的疾病[1，2］．盡管患病率較低，但rd是一種共同的疾病，涉及6 - 10%的人口，在最佳臨床實踐、診斷可達性、衛生服務規劃和公共衛生項目方麵為整個社區提出了關鍵問題。rd的確切數目仍不清楚:估計接近和超過8000種情況[3.，4］．大量的RDs是由於單個基因功能的改變，而隻有一小部分RDs識別非遺傳的致病因素。在這些案例中，環境暴露、體液生物標記物和藥物假設的記錄以及風險因素的識別對於支持初級預防行動至關重要(即母親葉酸水平和神經管缺陷、產前抗癲癇藥物暴露等)[5］．

RDs通常是複雜的情況，需要綜合的、長期的護理提供環境和高度專門設計的管理，由於主要發生在兒童時期，兒科專家幾乎不可避免地參與其中。盡管RDs的病程是慢性的，而且常常是進行性的，但早期診斷可減輕或延遲其長期並發症;最佳管理和及時的支持性和/或針對性治療。此外，適當和及時的診斷可改善病人的健康狀況，減輕疾病的心理和社會負擔，並可提供適當的遺傳谘詢[6］．在過去的十年中，科學界做出了大量努力，通過先進的分子研究來提高rd的診斷率。這使我們能夠更好地理解RDs的分子方麵，支持診斷、臨床決策、更合適的治療選擇，並可能降低經濟成本。

即使如此，對於大約一半的RDs患者，仍未發現明確的診斷[7］．因此，對如此多的病人及其家屬來說，身體、心理和社會後果是每天都要承受的相關負擔。在這方麵，未解決的病例(正式定義為未診斷的RDs (URDs))代表了一個巨大的額外障礙，需要解決的問題除了極其專業的臨床中心、傑出的分子研究、共同的協議、國家和國際層麵的專門行動，如發展國家“未診斷的RDs計劃”。這些項目有先進的操作程序，基於個性化的、詳盡的和結構良好的方法，由多學科專家團隊對URDs病例進行治療。

2008年，美國國立衛生研究院(NIH)啟動了首個未診斷疾病項目(UDP)，以解決美國醫療保健係統中未被滿足的需求:未診斷的RDs病例的診斷[8，9］．2014年，受美國UDP的啟發，國際未診斷疾病網絡(UDNI，http://www.udninternational.org/)由五個參與國家(包括意大利)創立[10，11，12］．國家罕見病中心(NCRDs) Sanità (ISS)是該網絡中的意大利代表。在歐洲其他經驗的基礎上，2016年，通過意大利外交部和國際合作基金，意大利未診斷罕見病網絡(IURDN)在意大利-美國雙邊項目中啟動[13，14］．IURDN旨在為URDs患者提供額外的機會，通過一個大型的專家社區獲得明確的診斷，這些專家大多屬於RDs國家臨床中心網絡，在一個全球協調的框架內共同工作[15］．因此，IURDN的主要目標是提高以前未確診個體的診斷率，以解決後續的臨床決策，提高醫療保健質量，確定新的病因，並促進國內和國際組織在URDs領域的凝聚力、協作和有意義的聯係。

在這裏，我們描述了IURDN的經驗、分析策略和在一個為期3年的項目中獲得的結果，強調了對臨床實踐中此類舉措的好處、局限性和成功因素的理解。

意大利未診斷罕見疾病網

IURDN於2016年成立，是意大利外交和國際合作部資助的為期三年的“未診斷罕見病:意大利-美國聯合項目”(PGR00229, 2016 - 19)的核心部分。其目的是提高診斷水平，優化對生活在意大利的未確診患者的管理。根據之前發布的詳細方案，明確了IURDN的調控原則(包括參與者的角色和功能、患者的選擇標準、數據收集和一般工作流程)[13］．該網絡由6個意大利rd專業技術中心為代表的獨立合作夥伴組成，是一個無等級的合作結構。1)．每個合作夥伴都可以自主管理自己的臨床病例，盡管在實現項目的共同目標方麵彼此相互依賴。國家罕見病中心(NCRDs) -國家高級醫院Sanità (ISS)作為整個項目的協調中心，負責:a)方案的協調;b)網絡治理，c)集中管理用於數據收集的數據庫表型，d)國際數據共享;E)透過專門的網站公布研究結果[14］．該網絡包括的所有6個臨床點都是意大利北部和中部地區的rd專家中心。

其中3個是協調區域民主發展網絡的中心(根據法律/ACT NO。1)罕見病臨床研究中心Mario Negri(倫巴第貝加莫);2) "聖瑪麗亞·德拉·米塞裏科迪亞"大學醫院(烏迪內、威尼斯茱莉亞弗留利);3)都靈大學免疫病理學和罕見病研究中心和S. Giovanni Bosco醫院(皮埃蒙特，都靈)。其他三個中心是:4)拉奎拉大學醫學遺傳學股(拉奎拉，阿布魯奇);5)費拉拉大學醫學遺傳學單元(費拉拉，Emilia Romagna);6) Tor Vergata大學分子遺傳學單元，(羅馬，拉齊奧)[13，14(圖。1)．

為了確保未解決的病例在轉診原因、發病年齡和臨床表現方麵具有預期的異質性，並考慮到跨學科的方法，參與中心具有不同的專門知識;三個地點還包括一個基因/基因組研究的實驗室核心(倫巴第、艾米利亞羅馬涅和拉齊奧)。

病人/臨床病例的招聘

臨床病例是從參與該網絡的六個意大利rd專家中心之一評估的患者中招募的。每個地點負責在轉介至其門診及住院診所作診斷用途的個案中，找出若幹最合適的本身未被診斷的個案。

委員會由臨床醫生、遺傳學家和NCRD-ISS和六個臨床中心的代表組成，定期在羅馬NCRD-ISS舉行麵對麵會議，向委員會提交臨床病例。並定期組織虛擬頭腦風暴會，討論個案研究。根據納入標準(見上文)選擇案例，由董事會進行分析和討論，步驟如下:

1.全體會議討論，看看臨床和輔助資料的聯合綜合重新評估是否能進一步有助於得到明確的診斷;

2.建議通過專門的基因/生化實驗室測試和/或尚未/以前進行的儀器調查排除可能的診斷;

3.對於仍未得到診斷的病例，已將所要求的數據輸入數據庫PhenoTipsISS(見上圖);

4.考慮全外顯子組測序(WES)，並討論其便利性;

5.對選定的案例進行功能性和進一步研究;

6.識別/收集若幹未確診病例，通過“現象中心”資料庫在國際一級共享(見上文)。

數字2展示了IURDN中未解決臨床病例的招募和納入過程的一個例子;罕見病臨床研究中心Mario Negri(倫巴第的貝加莫)擔任倫巴第地區罕見病網絡協調中心(根據第11號法令)。2001年第279號，以及隨後於2017年1月更新的DPCM)。1992-2015年期間共記錄了11.279例RDs轉診患者:其中65%來自倫巴第，35%來自意大利其他地區。總人數中的12%(11.279人中的1329人)沒有明確的診斷，被轉介到其他區域中心的專家進行二次或進一步的診斷。在11.279例患者中，125例(9%)最終被定義為未診斷病例，並接受了仔細的周期性重估。125例患者中，隻有15例(12%)被中心選中接受IURDN的進一步討論。由於該中心在成人腎髒疾病方麵擁有出色的臨床和研究經驗，因此選定了一些未解決的病例。

入選標準

患者被選擇為他們未診斷的疾病的獨特特征和潛在的揭示他們的條件的細胞生物學或生物化學的新方麵。候選病例的臨床體征和症狀尚未明確識別或可歸因於已知的RD，盡管進行了廣泛的臨床調查並有許多專家長期就診(仍未作出診斷)。

納入標準，如其他地方所述[13，14]，分別是:一個)雖然進行了廣泛和徹底的調查，但沒有明確的臨床診斷;b)缺乏明確的分子診斷，盡管臨床表現支持一個眾所周知的診斷(即沒有假設/證明因果關係超過已知的基因型-表型相關性);c)兒科或成人病人;d)常見或零星病例，種族隔離。

與任何未確診患者之前的綜合評估相關的最小數據集包括完整的臨床評估和診斷研究:

1. 我)

   生化(即酶、離子、抗體);

2. (二)

   儀器測試(即超聲、非神經係統、核磁共振、神經心理測試);

3. 3)

   生物樣本:(即活檢);

4. (四)

   遺傳學:(即核型、染色體芯片分析、靶向單基因、基因麵板測序)。

ISS患者數據庫-表型

該軟件用於收集和分析所選臨床病例的表型信息。PhenoTips“(16]是為該項目的而使用及定製的(PhenoTipsISS)．這一基於網絡的應用程序提供了一種標準化的、可索引的數據收集、測量和生長曲線的方法，並根據輸入的數據進行診斷指導，同時也實現了其他數據庫之間的互操作性，其中包括人類表型特征。此外，人類表型本體論(HPO)詞彙在PhenoTipsISS保證一個標準化的表現型［17，18］．該工具包含超過8000個術語，代表個體表型異常，在線孟德爾遺傳(OMIM)中的所有臨床條目都已注釋了HPO的術語。

訪問PhenoTipsISS受到關鍵代碼的限製，經過認證的參與者與特定的工作組聯係在一起，工作組的名稱相應地分配給參與者所屬機構。用戶有兩種不同的角色:查看者(查看患者數據，但不能修改數據)和貢獻者/數據所有者(對數據的實現和對自己輸入的數據的修改做出貢獻)。UDN-ISS工作組是服務器管理員(管理訪問權限和高級設置)，擁有對整個數據的完全訪問權，以及修改或刪除所有數據的能力。

首先，每個病人都被輸入PhenoTipsISS根據項目的需要和有關中心的專門知識確定的十個類別之一:結締組織疾病、內分泌遺傳學、智力殘疾綜合症、代謝紊亂、運動神經元疾病、先天性多重異常綜合征、肌病、腎髒疾病、骨骼發育不良、全身自體炎症綜合征。

數據庫收集的數據包括:患者信息(檢查日期、性別、轉診指征);家族史和譜係(父係種族和全球遺傳模式);產前及圍產期病史(妊娠史及圍產期並發症);病史(全球發病年齡);測量和生長圖表;臨床症狀和身體檢查結果;基因型信息(包括已確定特征的基因列表);拷貝數變異;診斷(包括可能與OMIM中列出的疾病相匹配)。進一步的詳細信息的顯tips軟件可在https://phenotips.org/．

國際數據庫和phenomcentral

基於在UDNI (http://www.udninternational.org/) [10，11]， IURDN的目標之一也是通過國際現象中心(International phenomcentral)分享至少5例未診斷病例，該中心是一個供臨床醫生和科研工作者使用的資料庫(https://www.phenomecentral.org) [19，20.］．為此目的，成立了一個名為“UDN-ISS意大利”的專門工作組，由國際信息網的代表組成。案件設定為“敵得過的並通過UDNI分享到phenomcentral。NCRD-ISS是管理者;輸入病例並接收多中心研究聯盟匹配患者的電子郵件通知的聯絡點。

基因組分析

下一代測序技術，主要是全外顯子組測序(WES)，通過先證者、父親和母親三人分析(先證者、父親和母親)對納入表型知識庫的病例進行分析。

外顯子組捕獲和下一代測序由Personal Genomics (http://www.personalgenomics.it/在Illumina HiSeq2000 (Illumina, San Diego, CA)平台上，使用熒光可逆終止子進行對端(2 × 100 bp讀長)合成測序。按照SeqCap EZ人類外顯子珠(Roche NimbleGen, Inc.， Madison, WI, USA)的方法進行外顯子組富集。

所有樣本均按照標準方案從患者外周血中分離dna，並對正常父母或未受影響的兄弟姐妹進行全外顯子組測序(WES)。使用CLC Genomics Workbench™軟件(CLC bio, Aarhus, Denmark)將序列reads映射到人類參考基因組裝配(GRCh37/hg19)。

根據從MutationTaster、CADD和polyphen2 web界麵獲得的致病性評分，對變異進行命名、過濾和排序。此外，變異與人類基因突變數據庫(HGMD，http://data.mch.mcgill.ca/phexdb)和已知的與纖毛病相關疾病相關的基因被優先考慮。

在家庭P0000076案例分析采用NimbleGen SeqCap EZ人類外顯子組文庫v3.0 (NimbleGen 64mb)外顯子組捕獲試劑盒(NimbleGen, Madison, WI, USA)，按照之前描述的製造商說明進行[21和富集文庫由Illumina Hiseq2000平台(Illumina, Inc.)進行測序。San Diego, CA)， 90 bp對端讀取。使用SOAPaligner和帶默認參數的BWA將測序結果與人類參考基因組(NCBI build 37.1, hg19)進行比對。snv和indel通過SOAPsnp (soap2.21) [22]及GATK(版本v1.0.4705) [23］．通過三個公共數據庫對檢測到的變異多態性位點進行篩選，包括1000基因組計劃(http://www.1000genomes.org/)、ESP (https://esp.gs.washington.edu/drupal/), ExAC (http://exac.broadinstitute.org/)及MAF > 0.5%及bgi -內部數據庫。由於父母親緣關係密切，我們采用純合子作圖分析[24]來首先檢測純合子區域，縮小候選基因列表。數字3.總結懸案的整個遞進(層級)過程。

倫理問題

IURDN使用由患者和/或其親屬簽署的兩種不同的知情同意書:一種用於將臨床病例納入IURDN，另一種用於進行基因組分析。兩種IC都是在研究開始時簽約的，並由參與的臨床中心保存。

在2016年3月至2019年6月期間IURDN舉行的麵對麵會議和電話會議期間，共收集和研究了110個案例。

110例中有39例(35.4%)因不符合納入標準而被排除。在任何情況下，委員會都無法根據現有的臨床記錄和調查作出明確診斷。

110例臨床病例中71例(64,6%)最終進入PhenoTipsISS，指的是先前指定的10個類別中的6個(表1)．沒有病例被診斷為代謝紊亂、肌炎、骨骼發育不良或全身自體炎症綜合征。

不同發病年齡的病例有明顯差異在表型中表達的類別:胎兒，新生兒，嬰兒，兒童，青少年和成人(無花果。4)．發病年齡從胎兒期至51歲不等。78.90%的個案(n= 56)，發病年齡小於16歲。其中22.5% (n= 16)出生時出現表型異常，1例在胎兒生命期發現;40歲的84% (n= 29例，年齡1個月~ 5歲;16.90% (n= 12例，年齡在5 ~ 15歲之間;19日,72% (n= 14)年齡大於16歲。

男女患者的性別分布相當，男性39例，女性32例。然而，這種分布表現出不同的模式，取決於出現體征和症狀的年齡:男性的數量較多(n= 31;62%)，而女性(n= 18;36%)發生在較年輕的患者中。

數字5中包含的案例的累積繼承模式PhenoTipsISS．情況主要是散發性的(N= 50;70年,4%);15日,5% (N= 11)為常染色體顯性;12日,7% (N9例為常染色體隱性遺傳;1、4% (N= 1)未知。

總體而言，在幾乎所有納入數據庫的患者中，疾病涉及多個器官;神經係統、關節/骨骼和眼係統確實是最受影響的。71例患者中有4例(5.6%)僅受累於肝髒，另有2例患者分別有全身自身免疫和內分泌表現。所有病例均為成人，無血緣關係。

數字6總結71例未確診患者的臨床和儀器證據所涉及的受累器官和/或係統。

基因組分析

家族性WES病例共選擇13/71例(18.3%)，家族性WES病例較少，WES調查總人數為20人(表3)2)．

在兩個病例(即表型P0000068和P0000076A和B病例標識符)中發現了導致疾病的變異，表明與以前未描述的表型相關的純合和雜合變異[25，26］．在5例病例中(即表型P0000043、P0000045、P0000077、P0000081、P0000085 A和B病例標識符)，雖然確認試驗仍在進行中，但發現了新的候選基因。在3個家族案例中(即表型P0000036、P0000039、P0000063病例標識符)，由於家族成員缺乏依從性導致調查未完成;對於這些病例，由於無法獲得生物樣本，分子調查暫時暫停。最後還有3個病例(一個家族)(即表型P0000030、P0000033和P0000086病例標識符)仍未解決(見表2)．

已偵破案件描述

表型的病例標識符:P0000068

既往描述的38歲男性RYHNS綜合征(色素性視網膜炎、垂體功能低下、腎病和骨骼發育不良)患者行WES檢查[27］．分析發現在纖毛基因中存在複合雜合子變異TMEM67，每一個都繼承自一個雜合子的父母。Sanger測序證實第6外顯子存在父係遺傳的無意義c.622A > T, p.(Arg208*)和母係遺傳的錯義變體c.1289A > G, p.(Asp430Gly)，幹擾了該基因第13外顯子的正確剪接，結果得到一個c.[622A > T];[1289A > G]基因型。在1000基因組計劃(ExAC)中沒有出現錯義變體。http://exac.broadinstitute.org)和基因組聚合數據庫(gnomAD，http://gnomad.broadinstitute.org）;相反，無意義變異在最全麵的變異數據庫中出現的頻率極低，在gnomAD中報告的277178個等位基因中有49個。

TMEM67基因，編碼跨膜蛋白meckelin，負責一組疾病稱為人類纖毛病(REF)。總的來說，TMEM67顯示了在纖毛病中觀察到的最廣泛的臨床連續，從早期致命性到成人肝纖維化。我們的發現擴展了雙等位基因導致的表型/綜合征的頻譜TMEM67目前有8種不同的臨床症狀，包括RHYNS綜合征[25］．在本例中，分子結果是在臨床診斷20年後通過WES獲得的。更早的檢測將使我們能夠采取以家庭為中心的針對性基因谘詢方法，以確定潛在的攜帶者，減少健康專業知識的不足，減輕家庭的情感壓力，以及對第二胎和第三胎嬰兒健康的揮之不去的擔憂。

在表型的案例標識符:P0000076A e P0000076B

這是一例來自巴基斯坦血統的近親繁殖家庭的兩兄弟，受早期牙齒脫落和牙骨質缺失形成的影響。對受影響的兄弟姐妹及其正常父母進行WES檢查(四口之家策略)。在保留了罕見的氨基酸變化變異後，研究了17個在患病兄弟中具有純合子變異和在正常父母中具有雜合子狀態的共享基因。WES顯示VCAN基因中H2665L純合子序列變異(Chondroitin sulfate protein oglycan 2, versican或CSPG2吉恩)兄弟倆的。

根據共有的基因組區域(近交)和等位基因頻率(小於0.5%)對變異進行優先排序。過濾過程結束後VCAN(硫酸軟骨素蛋白多糖2,versican或CSPG2)在8號外顯子(c.7994A > T;p.His2665Leu;5號染色體:82836816;GRCh37 / hg19) (NM_004385.4)。純合子序列變異存在於兩個受影響的兄弟和雜合子的父母。在ExAc和1000G數據庫中變異MAF = 0，在gnomAD中僅報道1例⁴在與疾病狀態無關的雜合基因型中。

桑格測序證實了這一發現。已知VCAN的顯性剪接突變會導致瓦格納綜合征或玻璃體視網膜病變。的確，玻璃體視網膜病的早期跡象是在哥哥身上發現的，盡管他的父母沒有表現出任何眼部病變。這是第一例特殊的發育牙齒異常相關的一個新的，純合子，隱性，錯義序列變異VCAN基因。因此，我們的發現擴展了表型突變場景和VCAN突變的遺傳模式[26］．再次，明確診斷允許在一個病例中發現玻璃體視網膜病變的早期跡象，從而進行聯合治療，以針對疾病的早期階段，防止進一步的並發症。

表型P0000077中的病例標識符

患者是一名來自摩洛哥的10歲女孩，父母是近親;這名兒童有嚴重的智力障礙，言語和語言發育遲緩。患者上瞼裂、下唇厚、鼻梁寬等畸形特征。攻擊性行為和刻板的動作也很明顯。WES分析發現先證物中TRAPPC9基因(販運蛋白粒子複合物，亞基9)的純合突變，並經Sanger測序證實。據報道，中東地區共有5例非綜合征性智力障礙患者出現TRAPPC9無義突變，但僅有少數患者出現腦異常和肥胖。2013年，在健康無血緣關係的父母所生的兩個意大利姐妹中發現了TRAPPC9的致病突變[28］．兒童有特殊的臉，肥胖，低張力，中度至重度智力障礙和大腦異常。檢測到TRAPPC9的純合剪接位點突變導致外顯子移碼跳躍和過早終止。考慮到巨大智力障礙綜合征的臨床和遺傳異質性，WES分析的成功對於獲得像現在這樣不太特殊的表型患者的診斷至關重要。

病例描述與等待診斷工作

表型的案例標識符:P0000043A和P0000043B

兩兄弟來自明顯健康的無血緣關係的父母，有特殊的相，肥厚性心肌病，脊柱側彎，錐狀胸，高促性腺功能減退症和輕度智力殘疾。其中一兄弟亦有先天性心房間隔開孔型心髒缺損。所有4個家庭成員均行WES檢查，結果顯示差異顯著性不確定;進一步調查正在進行中。

表型的病例標識符:P0000045

先證者在正常妊娠和分娩後足月出生。她是非血親健康父母的第二個孩子。出生後不久就被診斷為嚴重的雙側高頻感音神經性耳聾。在那個年齡，斑丘疹性病變也變得明顯，整個軀幹，而沒有麵部區域。長期慢性皮炎演變為瘢痕疙瘩組織。該女孩還遭受反複粘膜皮膚念珠菌病和乳牙過早脫落。淋巴細胞減少伴CD4/CD8比值異常。皮膚檢查發現雙側眼瞼多餘，彌漫性表皮增厚，唇炎和痤瘡病變。隨後出現明顯的足底和手掌角化過度，嚴重程度加重。沒有注意到手指上有收縮的帶子。 A de novo mutation c.426C > A (p.Phe142Leu) of the gene GJB2 was found at exon sequencing. Functional studies are advancing.

表型的病例標識符:P0000081

這個8歲的女孩是健康無血緣關係的父母所生的第二個孩子。她的哥哥也很健康。

圍產期病史不顯著，出生時人體測量數據在正常範圍內。既往有下呼吸道及尿路感染反複發作。孩子表現出特殊的相和出生後相稱的矮小身材;她的聲音不正常;運動和語言的發展被推遲;自嬰兒期起，多動行為與智力缺陷一起也很明顯。標準核型，array-CGH, FMR1甲基化，亞端粒重排和FISH(11 p15.5 8 q24.11)分析均為陰性。

臨床圖像高度提示漂浮港綜合征，SRCAP基因34外顯子的Sanger測序/外顯子測序顯示一個從頭截斷突變(c.7371delT)，可能是致病的。與以前的案例一樣，功能研究正在進行中。

表型的案例標識符:P0000085A和P0000085B

一個妹妹和他患病的弟弟是由非近親意大利健康的父母所生。第三個兄弟顯然也很健康。姐妹和兄弟都有外胚層發育不良，有強直瞼球炎、皮膚紋狀、指甲發育不良、毛發粗糙、足底角化過度。無低汗性病變。手、腳雙側並指在第2、3指之間。無法獲得所有家庭成員的血液樣本;因此，隻有受影響的兩兄弟考慮使用WES。對兩兄弟共有的等位基因頻率小於或等於0.5的常體細胞純合子和雜合子變異體進行了評估:在純合子和雜合子條件下分別發現20和150個不同的變異體。根據這一結果，一個可能的候選基因被催眠，進一步的分析目前正在調查中。

懸案描述

在表型的案例標識符:P00000030

這是一個家族性多發性脂肪增多症的病例，遺傳為顯性特征。先證者是兩個姐妹和一個兄弟。他們已故的父親和至少兩個表親也被認為患有多發性脂肪增多症。

將WES擴展到所有三個先證者和他們未受影響的母親，加上一個受影響的父親的第一個表親:在個體中總共發現了4669個常見變異。對這些變異的分析不能確定診斷。該研究還包括了另一個類似的區域，目前正在進行snp陣列分析，以最終確定連鎖區域，並將這些結果與WES結果結合起來。

表型的案例標識符:P0000033

她的父母都是健康的，沒有血緣關係，她有運動和認知遲緩。腦MRI顯示胼胝體部分發育不全，側腦室擴張。WES分析實際上正在進行中。

表型的病例標識符:P0000086

這是一例姐妹和她的兄弟影響成釉不全和雙側感音神經性聽力損失。父母是近親。哥哥很健康。WES分析對先證者和她健康的父母進行了分析。27個純合子和100個複合雜合子變異被鑒定出來，但他們的分析沒有結論性。將對健康的姐妹和受影響的兄弟進行分析。

在國際層麵共享病例(UDNI)

根據UDNI聲明，12例未診斷的臨床病例隨後被選擇通過phenomcentral在國際層麵共享。該項目的這一階段使這些案例與研究社區在Web存儲庫phenomcentral中注冊的其他類似案例相匹配。總的來說，12例患者中有7例顯示出與其他患者匹配相似度不同的潛在匹配。為了探索更多的匹配，上傳了匹配患者的研究小組之間的額外比較正在進行中。目前，隻要有新的數據條目可用，就會繼續進行匹配過程。

專門的網站

專門網站(http://www.udnpitaly.com/eng-home)也是為了更好地解釋項目的目標和最終結果，傳播參與者的活動，並為網絡中涉及的每個臨床中心創建一個可訪問表型的操作平台[14］．

為了應對rd經常麵臨的日益複雜的挑戰，衛生當局和科學界需要超越傳統的政策和服務。他們需要設計和試驗大膽創新的解決方案，並在基因組技術明顯驅動許多疾病診斷過程的時代維持先進的健康項目。因此，基因組醫學目前被用於調查複雜的情況，包括可疑的單基因疾病，在產前，兒科和成人年齡，特別是當涉及到三級臨床中心[29，30.，31］．

診斷不足和誤診是rd患者及其家庭的一個眾所周知的負擔，他們也受到焦慮和抑鬱的折磨，大約40%的未診斷兒童的父母都經曆過這種情況[32］．在這方麵，Knott等人報道了一個澳大利亞家庭在為其女兒診斷Rett綜合征變體時的掙紮和模範經驗[33］．作者描述了在世界其他地方可能發生的許多未解決的複雜疾病的漫長診斷旅程的場景，促使人們注意到，可能由於缺乏特定的篩查測試和對rd的知識有限，多年來病例未被診斷的高比率。臨床醫生在考慮診斷時應該了解可能的臨床表現和特定疾病的新變體的範圍。診斷延遲確實是一個主要問題，對患者和家庭的生活質量都是一個重大挑戰[33，34］．臨床外顯子組測序在疑似患有遺傳疾病的危重嬰兒診斷中的應用已在大量嬰兒樣本中得到證實。診斷率約為40%，並被證明對臨床決策過程有積極影響[29］．當研究轉向基因組分析時，許多兒童和成人患者的未解決疾病最終被診斷為患有罕見疾病[35］．以基因組技術為中心，為未被診斷的人建立全國性的組織良好的計劃，可以有係統地提高援助的質量，安排有針對性的保健服務，更大程度地參與這類病人的護理，確保及時和適當的診斷、適當的治療和為其家人提供適當的遺傳谘詢。

在許多國家，旨在解決未確診病例的項目目前正在開發中，並迅速增長。2008年，美國國立衛生研究院(NIH)啟動了未診斷疾病計劃(UDP)，以提高神秘疾病的診斷率[8，9］．發起這項行動的一個主要原因是考慮到，美國約有三分之一的患者需要幾年時間才能得到正確的診斷，其中約15%的患者需要5年以上的時間。此外，向遺傳和罕見病信息中心谘詢的人中至少有6%是尋求明確診斷的人[8，9］．建立該項目的第二個關鍵動機是，通過聯合不同的專業知識，加強對具有相關和/或描述的臨床表現的已知和新疾病的生物化學、生理學和細胞生物學的新見解。2013年，美國國立衛生研究院的共同基金支持了一個全國性的未診斷疾病網絡(UDN)，該網絡的建立是為了彙集美國各地傑出的臨床和研究中心，使用先進技術解決最具挑戰性的醫學謎團[8，9］．2014年，受美國UDN的啟發，國際未診斷疾病網絡(UDNI，http://www.udninternational.org/)獲得資助，最初參與的國家有五個:奧地利、保加利亞、匈牙利、意大利和瑞典。從那時起，越來越多的國家加入了該方案，目前澳大利亞、比利時、加拿大、法國、德國、印度、以色列、日本、韓國、西班牙、斯裏蘭卡、荷蘭、泰國和美國加入了該網絡。UDNI的主要目的是為患有未確診疾病的人提供最終診斷的機會，在國際層麵分享臨床信息和基因組數據[10，11，12］．基於參與成員采用的原則和實踐的共識框架，UDNI是一個獨特的、蓬勃發展的全球倡議範例，旨在在世界範圍內分享和驗證rd方麵的知識和經驗。在所有這些開創性的經驗之後，其他類似的UDP倡議已在單一的歐洲國家(奧地利、保加利亞、匈牙利、瑞典、意大利和西班牙)和世界其他地方(日本、韓國、澳大利亞、印度和加拿大)推出[10，11，12］．

意大利未診斷罕見病網絡(IURDN)於2016年在意大利外交和國際合作部資助的意大利-美國雙邊項目中成立。在這方麵，作為美國國立衛生研究院(NIH)在URDs方麵的多個國家(即美國未診斷疾病網絡)和國際(未診斷疾病國際網絡)努力和倡議的創始人，意大利項目可以利用這些經驗、協議和標準操作程序方麵的重要知識。

該項目是由國家罕見病中心在Sanità (www.iss.it在羅馬)。主要目標是:一個)通過意大利臨床專家中心網絡收集未解決的臨床病例(根據法律/ACT NO。2001年第279號和隨後的2017年1月更新的DPCM);b)建立一個國家數據庫，以促進國際層麵的數據分享;c)加強意大利和美國之間的合作，分享表型和基因組數據，獲得第二意見和實現最佳實踐[13］．事實上，IURDN的推出是為了在一個全球協調的框架內，通過有價值的專家意見和尖端分子技術，為生活在意大利的urd患者提供額外的機會，以獲得明確的診斷[15］．

3年內共入選71例，納入IURPN數據庫;大多數未結案的兒童年齡在0到5歲之間。這並不奇怪，因為RDs的發病通常發生在生命的最初幾年[34］．數據也與美國國立衛生研究院未診斷疾病項目報告中的證據相一致，該項目中有兩個年齡高峰相關:一個在4到6歲之間。出生時和16到18歲之間檢測到的情況。嬰兒發病的疾病[36］．在我們的研究中，兩性的性別分布非常相似(1男1女)。當隻考慮兒童患者(< 16歲)時，正如其他作者觀察到的，分布顯示男性(62%)高於女性(36%)[37，38］．智力障礙綜合征和多種先天性異常是未診斷的情況中最具代表性的類別。我們使用了軟件工具Phenotyps收集和標準化描述臨床特征範圍的術語。未確診患者的表型數據通常以一種高度可變的臨床注釋模式報告，從簡單的表型清單到大量的論文報告[39］．這可能會減少或阻礙對表型和基因組數據的有益結合所必需的仔細表型的價值。相反，深度表型可以對疾病的表現進行係統的分類。使用來自人類表型本體(HPO)的標準化術語，所有在URDs上運行的國際程序，包括我們目前采用基於網絡的應用程序來構建表型信息。已經表明，基於計算機工具的精確和詳細的表型描述也有助於解釋基因組數據，加快新生兒重症監護病房嬰兒的最終診斷，改善新生兒結局和住院費用[40］．

在我們的研究中，共有13/71(18.3%)的家庭病例被選擇為WES特征，少數病例是家族性的，導致WES調查的總人數為20人(28.2%);這些導致了7/13個新發現的基因/變異的診斷，使患者在許多年後有可能得到診斷。選擇的患者數量較低與該項目相對有限的財政支持有關，盡管如此，仍實現了53.8 %的分子診斷率。這一數值與過去幾年其他研究報告的兒科和成人未診斷疾病的診出率相當(25-50%)[40，41，42，43，44］．

雖然基因組研究通常用於漫長的診斷過程的結束，但在標準調查和單基因或多基因麵板測序之後，在許多學術中心中，WES是疑似遺傳疾病患者最受歡迎的分子診斷測試，對患者提供了比傳統分子測試更高的分子診斷結果[45，46，47］．這些結果為WES作為疑似單基因疾病的一線分子檢測的診斷和臨床應用提供了強有力的證據。Stark等人報告稱，在相關比例的嬰兒中，通過使用基因組分析，臨床管理和遺傳谘詢明顯受益，診斷率很高[30.］．優勢還包括健康和心理社會影響、生殖結果以及可能的成本效益[37］．盡管如此，將外顯子組測序作為未確診病例的一線研究(就像我們在一些病例中所做的那樣)值得專家和利益相關者進一步評估，因為這種態度在某些情況下可能會削弱實踐和教育中醫療保健的最佳臨床推理。

值得注意的是，許多接受基因組測序的患者仍未得到診斷;在這種情況下，多種數據類型的集成可以進一步改善診斷。最重要的是，基於基因組分析結果的額外臨床表征已被證明可以提高診斷的百分比[44］．然後，來自模式生物(果蠅，斑馬魚，秀麗隱杆線蟲等)，RNA測序(trascriptoma)和小分子代謝物(代謝物瘤)數據可以提高未診斷條件下的診斷產量[35，39］．

除了識別疾病基因作為以前未解決病例的診斷線索外，該項目的進一步目標是研究未知臨床意義的候選變異，並在國際平台/網絡上共享來自未診斷患者的數據。在IURDN和UDNI成員之間共享-組學和表型數據確實是該計劃中陳述的一般原則之一。正如UDNI董事會成員所指出的[10，11，12]，每個參與者通過國際Phenome Central知識庫共享至少5例未診斷病例，供臨床醫生和在RDs領域工作的科學家使用[18，19，20.］．

鼓勵國際合作將意味著允許臨床醫生找到匹配，找到相同未解決疾病的額外病例，並聯係世界各地的提交者。案例以一種開放和高度可見的方式參與，同時尊重患者的隱私。一旦用戶輸入他們患者的數據，他們就會連接到phenomcentral中共享類似表型和基因型的其他患者檔案。PhenomeCentral提供了一個基於表型提示軟件的用戶友好的web界麵，用戶可以輸入患者的去識別數據，也可以通過從私人表型提示裝置繪製現有的患者記錄[20.］．PhenomeCentral支持測序數據上傳。根據數據保護法規和倫理考慮，共享數據需要患者知情同意。PhenomeCentral中的每個患者記錄也可以通過設置不同的全局共享權限來完成:私有(記錄隻對所有者可見)、匹配(用戶可以發現匹配的病例，但沒有所有者的顯式權限無法訪問完整的病例)、公共(所有注冊用戶都可以查看輸入的病例)。有關PhenomeCentral的更多信息，請訪問:https://www.phenomecentral.org/．在我們的係列中，12例患者中有7例顯示了潛在的匹配，在phenomcentral中與其他患者的匹配相似度的相關性百分比不同。雖然還需要進行更深入的比較，但這些發現強烈鼓勵臨床醫生參與專業的國際平台。

診斷不足和誤診是rd患者及其家人的一個重要負擔;國家和國際合作是培養和解決問題的基礎，主要是由於患者的獨特性。外顯子組測序在未確診患者的常規臨床實踐中的廣泛采用和使用有望提高診治率，如果患者的表型不適合進行特定的傳統分析，則可以降低檢測成本，同時改善患者的預後和疾病管理，並重新強調發現新的治療模式。近年來，隨著如何改進rd診斷的項目在國家和國際層麵的實施，已經逐步獲得了大量的經驗。組織良好的項目應該考慮的一係列特征是專家之間的合作和團隊合作，衛生保健專業人員提高他們的基因組學能力的教育資源，對年輕研究人員的研究培訓，長期資助的項目。這些項目的目標顯然是對那些無法得到及時醫療診斷的最複雜的疾病作出及時和適當的診斷。10，11］．這些舉措的其他無疑的結果將是減少未確診個人的社會孤立、新的管理規程、藥物再用途研究、得到支持的臨床培訓、基礎和臨床研究發展、預防並發症和促進全球健康。

在2016-2019年期間，IURDN已包括越來越多的意大利專業技術中心，從而提供了一個能夠在國家和國際層麵分享其成果的平台(UDNI)。希望在未來這個網絡將繼續擴大它的範圍，使更多的臨床醫生和科學家，利用它的資源為未確診的患者提供答案。

在當前研究中生成和分析的數據集尚未公開。應用軟件“表型提示”(https://phenotips.org/)．

這個應用程序是為項目的目的而使用和定製的(表型)。

如有需要，可向通訊作者索取資料。

RDs:

罕見疾病

國家衛生研究院:

美國國立衛生研究院

人類®:

在線孟德爾遺傳在人類

UDP:

未確診的疾病項目

UDNI:

國際未診斷疾病網絡

NCRDs:

國家罕見病中心

空間站:

Istituto Superiore di Sanità

IURDN:

意大利未診斷罕見疾病網

韋斯:

全外顯子組測序

集成電路:

知情同意

一個也沒有。

“未診斷的罕見病:意大利-美國聯合項目”(PGR00229, 2016-19)，意大利外交與國際合作部(科學對應)。d . Taruscio博士)。

作者和聯係

1. 國家罕見病中心，未確診罕見病部門間股，意大利羅馬高等醫院Sanità

   馬可·塞爾瓦托和多米尼克·塔魯西奧

2. 卡塔尼亞大學教育科學係，意大利卡塔尼亞

   Agata Polizzi

3. 國家移植中心，意大利羅馬高等醫院Sanità

   Maria Chiara De Stefano

4. 生命倫理單元，Istituto Superiore di Sanità，意大利羅馬

   喬凡娜Floridia

5. 都靈大學臨床和生物科學係、S. Giovanni Bosco醫院、免疫病理學和罕見病研究中心-國家罕見病網絡區域協調中心，意大利都靈

   Simone Baldovino, Dario Roccatello, Savino Sciascia和Elisa Menegatti

6. 國家罕見病網絡區域協調中心，罕見病臨床研究中心" Aldo e Cele Daccò "，拉尼卡，貝加莫，意大利

   Giuseppe Remuzzi, Erica Daina & Paraskevas Iatropoulos

7. 國家罕見病網絡區域協調中心，S. Maria della Misericordia醫院，烏迪內，意大利

   布魯諾·本比和羅薩莉亞·瑪麗亞·達·裏奧爾

8. 費拉拉大學實驗與診斷醫學係，費拉拉，意大利

   Alessandra Ferlini & Marcella Neri

9. 托爾韋爾加塔大學生物醫學和預防學係，托爾韋爾加塔大學醫院，醫學遺傳學單位和IRCCS神經醫學，意大利波茲利

   朱塞佩Novelli

10. 托爾韋爾加塔大學生物醫學和預防學係和托爾韋爾加塔大學醫院醫學遺傳學單位，意大利羅馬

    Federica Sangiuolo

11. 意大利拉奎拉大學醫學遺傳學股生命、健康和環境科學係

    弗朗西斯科·Brancati

貢獻

每個作者都對論文的概念、工作的設計以及對工作起草的數據的獲取、分析和解釋做出了實質性的貢獻。每個作者都批準了提交的版本(以及任何涉及作者對研究貢獻的實質性修改版本)，並同意對作者自己的貢獻負責，並確保與工作任何部分的準確性或完整性相關的問題，即使是作者本人沒有參與的問題，得到適當的調查、解決，並在文獻中記錄解決方案。

相應的作者

對應到馬可·塞爾瓦托．

倫理認可和同意參與

不適用於本文。

同意出版

不適用於本文。

相互競爭的利益

作者宣稱他們之間沒有利益衝突。

出版商的注意

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