MKRN3和KISS1R在早熟和性早熟中的突變

背景

青春期時間已知受各種遺傳、營養、環境和社會經濟因素相互作用的影響，盡管青春期脈動GnRH分泌增加的最終機製尚未完全闡明。我們研究的目的是驗證KISSR1(以前叫GPR54),MKRN3青春期時間的基因。

方法

我們分析了13名8歲前出現青春期的中樞性早熟(CPP)女孩和6名8 - 10歲青春期提前(EP)女孩這些基因的DNA序列。

結果

直接測序KISS1R(GPR54)基因顯示兩個SNPs。一個SNP是一個誤義變體(350,132盧比)，此前已報道與韓國女孩的CPP有關。我們發現的另一種變異GPR54rs764046557基因是位於該氨基酸第5外顯子第209位的錯義SNP。我們隻在一位CPP患者中發現了這種變異。自動測序MKRN3在所有患者中，有八名受試者發現了三種變異。19例患者中有6例(31.5%)(3/13 CPP患者和3/6 EP患者)發現同義變異c.663C > T (rs2239669)。在我們的一位CPP患者中發現了另一個同義變體(rs140467331)，在另一位CPP患者中也發現了一個錯義變體(rs760981395)。

結論

綜上所述，我們確定了序列變異KISS1R而且MKRN3這是ICPP最常見的兩種遺傳原因。我們的結果提示這些變異可能是CPP發病的誘導因素。

青春期是一個複雜的性發育生物學過程，由下丘腦水平的脈衝促性腺激素釋放激素(GnRH)分泌的激活控製，它刺激激素級聯和性腺激活[1］．

青春期時間已知受各種遺傳、營養、環境和社會經濟因素相互作用的影響，盡管青春期脈動GnRH分泌增加的最終機製尚未完全闡明[2］．

中樞性性早熟(CPP)在臨床上可通過第二性征的發育來確定，如女性在8歲前乳房發育(根據Tanner分類為B2)，男孩在9歲前睾丸體積增加。盡管人們努力建立人類正常和早熟的青春期時間的遺傳機製，但它在很大程度上仍然未知[2］．然而，功能獲得突變KISS1而且KISSR1(以前叫GPR54)基因和makorin無名指蛋白3的功能缺失突變(MKRN3)基因可導致CPP [3.，4，5，6］．

Kisspeptin的肽產物KISS1基因及其受體g蛋白54 (GPR54)信號複合體，是GnRH神經元青春期激活的關鍵看門人[2，7，8，9，10，11］．kisspeptin信號的增加，由增強的表達引起KISS1而且GPR54青春期開始時的基因，有助於促性腺作用軸的激活。因此，功能獲得突變KISS1或KISSR1基因可能誘發青春期早熟的激活。

另一方麵，阿布瑞尤等人[6]，使用全外顯子組測序方法，檢測到編碼makorin無名指蛋白3的基因中的有害突變，該蛋白3通過抑製因子刺激青春期脈動GnRH分泌而起作用[12］．

2014年以來，人們認識到KISS1、KISS1R和MKNR3在青春期早熟中的作用[13］．在這項研究中，我們分析了這些基因的DNA序列在一些受CPP影響的女孩。此外，我們還研究了另一組受“早熟”(EP)影響的女孩的同一基因中snp的存在，“早熟”被定義為在8到10歲之間青春期開始的女孩，其胸部發育比正常女性的平均年齡要早。我們的目的是驗證KISS1R和MKRN3在這些受試者的青春期時間上的可能作用。

主題

我們納入19名女性受試者，其中13例為CPP, 6例為EP。在臨床檢查中，診斷為CPP的患者必須滿足以下標準:高於平均身高、生長速度增加和骨齡延長(使用Greulich和Pyle Atlas進行評估);盆腔超聲證實CPP為8歲以下女童，經GnRH刺激和垂體MRI掃描後，發現子宮縱向直徑超過3.6 mm，卵巢容積高(> 2 ml)，血清LH峰值高於5iu /L。在預期青春期的女孩中，同樣的臨床和實驗室特征發生在8至10歲之間。

青春期提前的女孩在8到10歲之間開始青春期發育，並迅速發展，就像青春期早熟的女性一樣。患者的臨床及激素資料見表1．

調查了青春期早熟的家族史，獲得了親本身高和青春期發育時間。

激素化驗

血清中LH(促黃體生成素)，FSH(促卵泡刺激素)和雌二醇(E₂)采用化學發光免疫測定法(西門子醫療解決方案診斷公司，意大利米蘭)測定。

對於GnRH刺激試驗，在給藥100 μg合成GnRH (100 mcg/m²)，分別於GnRH給藥後0、15、30、90 min采集血清黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的測定。LH法檢測限為0.1 IU/l。我們認為刺激的LH水平超過5iu /l作為青春期的截止。

基因分析

使用麥克斯韋16儀器(Promega)從所有患者的外周血單個核細胞(PBMC)中分離基因組DNA。所有編碼外顯子(外顯子1到5)和內含子側翼區域KISS1R (GPR54)基因用前麵描述的5對特異性引物進行PCR擴增[7］．的整個編碼區MKRN3(GenBank登錄號NC_000015.1)使用Abreu等人描述的三對引物進行PCR擴增。[6］．為了確認rs760981395變異在我們的患者中存在，我們使用了另一種自製的Primer3軟件設計的反向引物。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上觀察，用溴化乙錠染色，以驗證PCR產物的存在。然後，根據製造商的說明，使用相同的引物對和BigDye終結者V3.1循環測序試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進行DNA測序反應。用ABI PRISM 310基因分析儀(Applied Biosystem)對測序反應進行電泳和分析。

臨床特征

CPP和EP患者具有生殖軸過早激活的典型臨床和激素特征，包括早期青春期體征，如乳房發育、生長速度加快、骨齡增大、卵巢體積和子宮縱向長度增大、E2水平升高和GnRH刺激的LH和FSH水平升高。具體臨床參數見表1．CPP患者平均發病年齡為7.46±0.22歲，EP患者平均發病年齡為8.5歲(均為8.5歲)。診斷時正負SDS的中位年齡分別為8.3±0.36歲和9.2±0.18歲;中位骨齡分別為10.25歲(9.25-10.75歲)和9.5歲(8.87-10.87歲)。中位GnRH刺激的LH水平分別為9.8 IU/L(範圍:5.8-25.5 IU/L)和8.2 IU/L(範圍:4.7-10.74 IU/L)，而中位GnRH刺激的FSH水平分別為12.5 IU/L(範圍:10.45-15.1 IU/L)和11.9 IU/L(範圍:8.4-12.4 IU/L)。E2中位水平分別為19.95 pg/ml(範圍:15.7-28.5 pg/ml)和24 pg/ml(範圍:18-27.4 pg/ml)。患者使用一種貯藏GnRH激動劑治療，導致青春期體征的充分臨床和激素回歸和衰老進程的抑製。

GPR54和MKRN3基因分析

直接測序KISS1R (GPR54)基因顯示兩個SNPs(表2)．一種SNP是誤義變體(rs350132)，此前已報道與韓國女孩的CPP有關[14以及對另一人群的研究[15］．我們在15/19例(79%)患者中發現了該SNP(10例為純合子，5例為雜合子;11/13例CPP患者和4/6例EP患者)。我們發現的另一種變異GPR54rs764046557基因是位於該氨基酸第5外顯子第209位的錯義SNP。我們隻在一位CPP患者中發現了這種變異。該患者rs350132多態性也是純合的。該變異(rs764046557)已被納入SNP數據庫(TOPMed全基因組測序(WGS)項目)，頻率T = 0.00002。

自動測序MKRN3在所有患者中，有八名受試者發現了三種變異。19例患者中有6例(31.5%)(3/13 CPP患者和3/6 EP患者)發現同義變異c.663C > T (rs2239669)。根據ExAC，該多態性的等位基因頻率為0.2815 [16］．

在我們的一位CPP患者中發現了另一個同義變體(rs140467331)，在另一位CPP患者中也發現了一個錯義變體(rs760981395)。這些變異已知並包含在SNP數據庫(ExAC)中，頻率分別為0.00002和0.00001，但據我們所知，它們尚未在與CPP有關的科學論文中被描述過。誤義變異導致了368位點的氨基酸替換(Ser到Cys)。

在兒科內分泌學實踐中，性早熟是一種非罕見的情況，在未經治療的患者中可導致最終身高短和生理不適[17］．越來越多的證據表明，青春期提前與以後生活中的不良健康後果(如乳腺瘤變風險)之間存在關聯。

青春期的開始在不同的個體和種族之間差異很大，而這種差異在很大程度上是由遺傳因素造成的。Kisspeptin及其受體GPR54似乎是青春期的關鍵調節因子[1］．自2003年以來，許多研究人員試圖找到與青春期發育變化相關的kisspeptin/KISS1R係統的分子機製。他們發現基因突變GPR54導致特發性促性腺機能減退症的基因[1，11，18，19］．

然而，CPP的遺傳基礎包括KISS1而且KISS1R基因或喪失功能的突變MKRN3基因。到目前為止,MKRN3已有來自35個不同家庭的58名CPP患者出現突變[2，6，12，20.，21，22，23，24];其中包括23種不同的功能喪失和11種錯義突變MKRN3自2013年被發現以來，是CPP最常見的遺傳原因[10］．Makorin無名指蛋白3由第15號染色體上的一個內含子較少的基因編碼，被認為對GnRH的分泌有抑製作用。它屬於連接酶E3家族中的一種，但其作用機製尚不清楚。

2008年，KISS1R的常染色體顯性錯義突變導致細胞內通路對kisspeptin反應的長時間激活，被認為是CPP的原因[4］．從那以後，再沒有其他CPP案例被激活KISS1R基因突變也有報道，但很少KISS1RCPP患者中已發現多態性[13，25］．在本研究中，我們檢測到一個SNP錯義變體(rs 350132c.1091 T > A)，該變體此前已被報道與韓國女孩的CPP有關[14以及對另一人群的研究[15］．這是一種非同義SNP，可誘導p.l leu364his的氨基酸取代，Yean jung Oh等人在矽分析中認為它是一種良性多態性。[25］．有趣的是，我們在CPP和EP兩組患者中都發現了這種SNP。因此，我們可以假設這種變異也可能與青春期的中度早發有關。我們發現的另一種變異GPR54rs764046557基因是一個錯義SNP，位於209位氨基酸的第5外顯子上。我們隻在一名CCP患者中發現了這種變異。這些患者的rs 350,132多態性也是純合的。這種變異已知並包含在SNP數據庫(TOPMed全基因組測序(WGS)項目)中，但此前沒有科學論文描述它與CPP或任何病理效應有關。

的分析MKRN3我們所有患者的基因在8個受試者中顯示出3種變異。19例患者中有6例(31.5%)(3/13 CPP患者和3/6早熟患者)發現同義變異c.663C > T。加性模型分析揭示了該SNP與男孩性早熟之間的顯著聯係，但相反，在CPP女孩中沒有發現相關性[26］．然而，ortizs - cabrera等人[17]在40%的女性患者中發現了這種變異(預期頻率為20%)，他們推測，一些snp雖然與蛋白質氨基酸鏈無關，但可能會影響該基因翻譯後特征的表達，導致功能障礙。

我們在兩名CPP患者中發現了另一個同義變體(rs140467331)和一個錯義變體(rs760981395)。這些變異已知並包含在SNP數據庫(ExAC)中，但據我們所知，它們尚未在與CPP相關的科學論文中被描述過。誤義變異導致了368位點的氨基酸替換(Ser到Cys)。

我們的病人沒有臨床或生物學特征提示MKRN3突變;事實上，在兩組中都發現了差異，即性早熟和性早熟。這與其他研究形成了對比，作者在其他研究中發現，有或沒有突變的女孩在中位年齡上存在顯著差異[27］．然而，有可能有些患者在青春期晚期就診，因此，從青春期症狀出現到診斷的時間可能不準確，因為這是根據父母報告的數據估計的。

我們的論文證實了基因突變和多態性的存在(並擴展了表型)KISS1R而且MKRN3不僅在ICPP患者中，而且在青春期早期受試者中。然而，我們的研究有一些局限性:我們不能進行功能研究來證明我們發現的變異的致病性;此外，無法從突變患者的父親那裏獲取DNA樣本以驗證父係遺傳，這在之前的報道中已經得到證實[16];最後，我們的樣本規模相當小。

我們已經嚐試識別序列變異KISS1R而且MKRN3基因是CPP最常見的兩個遺傳原因，我們的研究結果表明，這些變異可能是CPP發病的誘導因素。此外，最近的兩項研究表明，在健康兒童和青少年中，循環MKRN3水平與青春期的Tanner階段呈負相關[27，28］．因此，建議對所有家族史不明確的家族性ICPP患者進行篩查，特別是MKRN3突變的篩查[3.]和散發CPP的患者[2］．同樣重要的是，家族性CPP繼發於患者的弟弟妹妹MKRN3對相同的突變進行篩選。事實上，這種方法確保了早期診斷和及時的GnRH激動劑治療。

在當前研究中使用和/或分析的數據集可根據要求從相應作者處獲得。

FSH:

促卵泡激素

韓:

促黃體激素

促:

促性腺激素釋放激素

E₂：

雌二醇

SD:

標準偏差

SDS:

標準偏差的分數

MKRN3:

Makorin無名指蛋白3

KISS1R:(或GPR54):

Kisspeptin激素受體

CPP:

中央性早熟

EP:

青春期提前

作者非常感謝帕維亞大學的母語教師Sheila McVeigh博士對手稿的英文修訂。

作者要感謝(意大利)帕維亞大學阿道夫·費拉塔醫學圖書館的工作人員提供的寶貴幫助。

作者還感謝意大利加利亞特(諾瓦拉)28066號“Il Bambino e Il suo兒”協會的後勤支持。

沒有資金需要申報。

作者和聯係

1. 帕維亞大學兒科和青少年護理中心內科和治療學係，意大利帕維亞43,27100

   Sara Pagani, Valeria Calcaterra, Chiara Montalbano & Mauro Bozzola

2. 免疫和移植實驗室，兒童血液學和腫瘤學，意大利帕維亞聖馬特奧IRCCS基金會

   格洛麗亞Acquafredda

3. 意大利羅馬，巴比諾兒童醫院兒科Gesù

   埃琳娜·博佐拉和阿爾貝托·維拉尼

4. 意大利羅馬天主教大學兒科研究所

   Pietro費拉拉

5. 意大利米蘭聖保羅醫院兒科

   曼Gasparri

貢獻

MB和AV設計了研究，修改了手稿，批準了最終版本。SP、VC、CM和GA進行實驗，收集並分析數據。SP和EB撰寫了手稿並修改了文獻。PF和MG提供了技術支持和概念建議。所有作者都閱讀並認可了最終版本的手稿。

相應的作者

對應到毛羅·Bozzola．

倫理批準和同意參與

倫理批準和同意參與。所有的研究都是按照人類參與者的道德標準進行的。該研究於2016年5月17日獲得了IRCCS聖馬特奧醫院基金會倫理委員會“帕維亞倫理區域委員會”的批準(參考編號20160005680)。所有參與者均提供父母書麵知情同意。

同意出版

所有參與者都提供了父母的書麵知情同意。

相互競爭的利益

作者聲明他們沒有競爭利益。

出版商的注意

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